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文庫是一種強大的工具，用于遺傳篩選，或鑒別未知的基因。文庫可以通過(guò)多種不同質(zhì)粒制備。在給定的文庫中，質(zhì)粒具有相同的主干，但它們表達或靶向不同的基因。一些文庫覆蓋了大部分基因組，而另一些則局限于某些基因。在cDNA文庫中，每個(gè)質(zhì)粒都有一個(gè)獨特的cDNA。在shRNA或gRNA文庫中，每個(gè)質(zhì)粒都包含一個(gè)獨特的基因靶向序列，但整個(gè)文庫中每個(gè)基因都有多個(gè)靶向序列。編碼文庫包含具有獨特的semi-random序列的質(zhì)粒，這些質(zhì)?？捎糜谘y追蹤或解析一次表達多個(gè)基因的效果等應用。

Addgene提供的文庫是在一個(gè)試管中混合多種質(zhì)粒。如果文庫被設計成只覆蓋一小部分基因，那么文庫就會(huì )很??；但它也可以很大(例如Moffat實(shí)驗室的Toronto KnockOut (TKO)文庫有超過(guò)175,000個(gè)包含不同gRNA的質(zhì)粒)。

一、gRNA文庫

gRNA文庫是通過(guò)一段與目標DNA相同的gRNA指導Cas9核酸酶對靶基因進(jìn)行DNA修飾，以此造成基因功能突變或缺失。gRNA文庫是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，在功能基因篩選、疾病機制研究及藥物研發(fā)等方面發(fā)揮重要的功能。

二、文庫的使用

一旦您從Addgene收到文庫后，請查看文庫信息，看看它是否應該先擴增，然后再進(jìn)行篩選。如果您需要先擴增文庫，請參考寄存人提供的方法，以獲得最佳效果。

對于某些文庫，質(zhì)粒DNA可以直接遞送到細胞內。而其他的，特別是集合慢病毒質(zhì)粒的文庫，必須先用于制造病毒。隨后，用這種混合病毒將質(zhì)粒運送到靶細胞。無(wú)論什么情況，都建議對大規模制備的 DNA進(jìn)行二代測序，以驗證文庫的完整性。不完整的文庫可能導致在以后的實(shí)驗中出現假陽(yáng)性或假陰性，并可能對數據的重現性產(chǎn)生負面影響。

三、文庫篩選分類(lèi)

在文庫篩選中，細胞以極低的MOI感染，確保每個(gè)細胞最多進(jìn)入一種質(zhì)粒。為了確保每個(gè)質(zhì)粒在群體中都得到充分的表達，您需要感染比文庫中質(zhì)粒數量多得多的細胞。例如，Moffat實(shí)驗室使用了高于TKO文庫中質(zhì)粒數量200倍的細胞。使用大量的細胞將可能導致假陽(yáng)性或陰性結果的影響最小化。

上圖概述了gRNA庫是如何使用的。以下是篩選過(guò)程中應采取的一般步驟：

1. 擴增文庫(電穿孔法和大規模制備法)。

例：#gRNA文庫# 構建的載體數量較少，不足以進(jìn)行文庫的慢病毒包裝和使用。因此，需要對載體進(jìn)行擴增。將gRNA載體構建完成后，我們將這些載體按相同的比例混合成一個(gè)pool（即載體混合庫），隨后將載體混合庫使用專(zhuān)用電轉感受態(tài)，電轉擴增培養并收集菌落，并進(jìn)行擴大培養，最后抽提質(zhì)粒，即得到了擴增后的載體混合庫，也就是文庫。

2. 如果通過(guò)病毒傳遞，則先制造病毒；這就創(chuàng )建了一個(gè)慢病毒CRISPR文庫。

例：擴增后的gRNA文庫在慢病毒包裝載體的輔助下轉染293T細胞，進(jìn)行慢病毒的包裝。由于gRNA文庫是由多個(gè)不同的gRNA載體混合而成，因此獲得的慢病毒是混合型病毒庫，每個(gè)病毒攜帶單個(gè)gRNA載體。

3. 將文庫遞送到靶細胞。

文庫篩選可分為兩類(lèi)：正篩和負篩。

正篩：

• 應用文庫

• 應用篩選（多數細胞死亡或未通過(guò)篩選（通過(guò)報告基因））

• 挑出通過(guò)篩選的細胞

• 細胞測序

• 得到通過(guò)篩選的基因列表

在正向篩選中，目標是識別那些選擇后存活下來(lái)的細胞。選擇壓力必須足夠強，使大多數細胞死亡，將它們的質(zhì)粒從集合中移除，只有一小部分細胞存活下來(lái)。收集存活的細胞后，對其質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴增并使用NGS測序，以鑒定其cDNA或目的基因。正向篩選通常是非常強大的，最初出現的數萬(wàn)個(gè)基因可能會(huì )縮小到幾百個(gè)或更少。

負篩：

• 應用文庫

• 對對照樣本進(jìn)行二代測序（無(wú)選擇性），平行應用文庫

• 應用篩選（多數細胞存活）

• 對比實(shí)驗組和對照組的測序結果

• 得到一個(gè)通過(guò)篩選而消失的gRNA列表

負篩比正篩要復雜一些。在負向篩選中，目標是識別出那些無(wú)法通過(guò)選擇機制存活下來(lái)的細胞。您將感染兩組細胞，其中一組進(jìn)行選擇，另一組作為非選擇的對照。然后使用NGS對這兩個(gè)群體進(jìn)行測序，以確定哪些質(zhì)粒已被選擇刪除。在CRISPR篩查中，負向篩選通常用于識別在特定條件下對生長(cháng)/生存至關(guān)重要的基因。

二代測序

二代測序技術(shù)允許在一次反應中同時(shí)對數百萬(wàn)個(gè)DNA片段進(jìn)行平行測序。如上所述，使用這種技術(shù)對于執行文庫篩選是至關(guān)重要的。

參考資料：

如需了解相關(guān)信息，可查看網(wǎng)址：http://www.addgene.org/guides/pooled-libraries/

• CRISPR指南，了解更多關(guān)于CRISPR/Cas9全基因組篩選的信息。

• 瀏覽病毒載體資源。

• 查看一些最受歡迎的文庫信息。

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