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研究背景

嵌合抗原受體(CAR)-T細胞在治療惡性腫瘤，特別是非實(shí)體瘤方面表現出顯著(zhù)的療效。

CAR-T細胞已被證明是一種新型的“活體”療法，它利用病人的免疫系統來(lái)識別特定的腫瘤相關(guān)抗原，并將工程化的T細胞重新定向到更有針對性的腫瘤細胞。

體外評估CAR-T細胞的生物功能通常涉及一系列勞動(dòng)密集型的共培養實(shí)驗和免疫測定，并且在驗證新的CAR-T細胞的過(guò)程中，重復性常常受到供體之間的差異和其他影響而不穩定。

為了解決這一挑戰，研究學(xué)者們提出了CAR-T靶向的熒光素酶報告癌癥細胞，這些細胞具有CD19、CD20和HER2的高內源表達，并且表現出敏感和穩定的熒光素酶表達報告，使您能夠實(shí)時(shí)監測候選CAR-T效應細胞在細胞毒性和細胞活力測定中的效力和功效，從而實(shí)現免疫治療突破。

解決思路

基于CAR-T細胞的療法已成為治療特定白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的一種有前景的免疫療法。

在這種治療難治性癌癥的令人興奮的方法中，通過(guò)單采從患者血液中分離T細胞，然后將這些細胞與細胞因子白介素2和抗CD3抗體一起孵化以刺激增殖。將參與移植物排斥反應的基因進(jìn)行離體沉默，改善了輸注后T細胞的穩定性。一旦擴增，適當的CAR通過(guò)逆轉錄病毒轉導被引入細胞中。然后這些有效的CAR-T細胞被輸回病人體內，使其對腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒性作用¹。

目前在開(kāi)發(fā)新的CAR結構方面已經(jīng)投入了大量的研究工作，以增加目標癌癥類(lèi)型的范圍并提高其抗腫瘤的療效。CAR-T發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)瓶頸是評估CAR-T細胞的生物功能。以往的經(jīng)驗中，會(huì )使用放射性?¹Cr釋放測定法，但是該方法只能在單一時(shí)間點(diǎn)獲得數據，且具有內在的放射性，試劑的半衰期、保護措施和廢物處理都是關(guān)鍵因素。

研究CAR-T效應功能的一種方法是生物發(fā)光（BLI）報告試驗，這種方法消除了?¹Cr釋放和染料負載測定的擔憂(yōu)。在BLI報告基因測定中，將構成性表達熒光素酶的靶細胞與候選效應細胞共同培養，并通過(guò)BLI信號的損失來(lái)監測細胞

毒性⁴。除了易于使用外，BLI試驗中表達熒光素酶的靶細胞可以提高實(shí)驗間的可重復性。

為了生成CAR-T靶向熒光素酶報告細胞，研究者們將Lenti-LUC2熒光素酶報告劑引入親代細胞系，進(jìn)行抗生素選擇和單細胞分選，分離出具有高熒光素酶表達的穩定克隆。

然后通過(guò)比較低通量和高通量報告細胞，驗證目標抗原和熒光素酶的表達穩定性。一旦選擇了穩定的克隆并驗證了抗原和熒光素酶的表達，報告細胞系就會(huì )用嘗試過(guò)的鑒定方法，如短串聯(lián)重復（STR）分析、支原體檢測以及細胞生長(cháng)速度和形態(tài)學(xué)檢測，對其進(jìn)行特征分析和鑒定。

CAR-T靶向熒光素酶報告細胞的性能在T細胞共培養實(shí)驗中得到了驗證。研究者們采用了市售的針對CD19、CD20和HER2的CAR-T細胞，將來(lái)自同一供體的空載體轉導的T細胞與之配對作為對照。CAR-T細胞對目標腫瘤細胞的細胞毒性是用熒光素酶測定法、市售的效力測定法以及明場(chǎng)和熒光活細胞成像測定法來(lái)測量的。

研究者們的結果表明，熒光素酶報告系統是測量癌癥和T細胞體外共培養物中生物過(guò)程的一種簡(jiǎn)單、強大和高度敏感的手段。

總之，來(lái)自ATCC的CAR-T靶向熒光素酶報告細胞是研究CAR-T生物功能和驗證用于癌癥免疫治療的新CAR-T藥物的特征鮮明、重復性高的工具。

圖1：CAR-T靶向熒光素酶報告細胞。示意圖顯示表達CD19+WIL2-S-Luc2和Raji-Luc2、CD20+Daudi-Luc2和Farage-Luc2以及HER2+BT-474-Luc2的CAR-T靶細胞分別被CD19、CD20和HER2靶向的CAR-T細胞包圍并攻擊。

新產(chǎn)品的誕生

目前，ATCCT推出的CAR-T靶向熒光素酶報告細胞產(chǎn)品如下：

這些方便的報告標記細胞可以消除涉及放射性或熒光染料標記的工作流程，使細胞保持靶抗原和熒光素酶的高表達，最高可達到30個(gè)群體倍增。這些靈活的靶細胞也可以被納入其他免疫腫瘤學(xué)應用中，如ADCC和自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性試驗。

• 靶抗原和熒光素酶的高表達穩定性

• 高信噪比（S/N）

• 生理相關(guān)的低E:T比率

• 高效能、完全認證的細胞系

• 易于使用的報告系統

• 可進(jìn)行實(shí)時(shí)活細胞成像

主要實(shí)驗數據

圖 2：CAR-T靶向熒光素酶報告細胞可被納入多種CAR-T療效檢測中。(A）表達CD19的Raji-Luc2細胞（B）WIL2-S-Luc2細胞作為CD19 CAR-T或Mock CAR-T（對照）效應細胞的靶細胞，來(lái)自同一供體的效應細胞與靶細胞的比例為所示。加入熒光素酶檢測底物，并檢測發(fā)光信號。信號消失表示細胞死亡；通過(guò)CD19靶向的CAR-T細胞的劑量依賴(lài)性特異性殺傷大于用模擬CAR-T細胞觀(guān)察到的非特異性殺傷。此外，用細胞標記染料對Raji-Luc2細胞染色，然后在與CD19 CAR-T效應細胞共培養期間進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光成像測量。(C）Raji-Luc2細胞（綠色）被效應T細胞包圍，與Mock-CAR-T細胞共培養相比，導致熒光下降。(D）在CD19 CAR-T效應細胞共培養6小時(shí)和24小時(shí)后，研究學(xué)者們觀(guān)察到熒光細胞的數量減少；然而，在與Mock CAR-T細胞共培養時(shí)，有許多Raji-LUC2細胞存在。這些結果表明，ATCC CAR-T靶向熒光素酶報告細胞可用于實(shí)時(shí)評估CAR-T細胞在生物發(fā)光實(shí)驗和活細胞實(shí)時(shí)成像中的潛力。

圖3：HER2 CAR-T對BT-474-Luc2的體外殺傷力檢測，使用發(fā)光法和xCelligence測量。(A) 將HER2陽(yáng)性的BT-474-Luc2細胞（5 x 10³）接種到96孔板中，作為同一供體的HER2 CAR-T或Mock CAR-T（對照）的靶細胞，CAR-T細胞與靶BT-474-Luc2細胞分別以不同的比例（1：1，2：1，5：1，10：1）接種。在共培養24小時(shí)后，將Bright-Glo加入到指定的孔中。使用發(fā)光板閱讀器在10分鐘內讀取板的發(fā)光情況，確定HER2 CAR-T細胞具有劑量依賴(lài)性的特異性殺傷力，大于用模擬CAR-T細胞觀(guān)察到的非特異性殺傷力（*=差異明顯，ns=差異不明顯，使用非配對t檢驗，單一的集合方差）。(B）HER2 CAR-T細胞以10:1的比例針對2×10?HER2陽(yáng)性的BT-474-Luc2，用xCELLigence系統測量細胞殺傷力。來(lái)自同一供體的模擬CAR-T細胞被用作對照。

圖4：使用發(fā)光和活細胞成像技術(shù)對Daudi-Luc2進(jìn)行CD20 CAR-T體外殺傷試驗。(A) 將CD20陽(yáng)性的Daudi-Luc2細胞（5 x 10³）接種到96孔板中，并用來(lái)自同一供體的CD20 CAR-T或Mock CAR-T（對照）的靶細胞，CAR-T細胞與靶Daudi-Luc2細胞分別以不同比例（1：1，2：1，5：1，10：1）接種。在共培養24小時(shí)后，在指定的孔中加入Bright-Glo。用發(fā)光板閱讀器在10分鐘內讀取板的發(fā)光，確定與CD20 CAR-T細胞有劑量依賴(lài)性的特異性殺傷，這比用模擬CAR-T細胞觀(guān)察到的非特異性殺傷要大（*=差異明顯，ns=不明顯，使用非配對t檢驗，有一個(gè)集合的方差）。(B) 在培養基中存在Incucyte Cytotox紅色染料的情況下，將Daudi-Luc2細胞（5 x 10³）與CD20 CAR-T細胞或Mock CAR-T細胞共同培養，并在24小時(shí)內每小時(shí)測量一次實(shí)時(shí)熒光成像，結果與CD20 CAR-T共同培養時(shí)，熒光強度比與Mock-CAR-T細胞共同培養時(shí)增加。(C）與CD20 CAR-T細胞共培養24小時(shí)后，與Mock CAR-T細胞共培養相比，Daudi-Luc2顯示死亡（紅色）熒光細胞數量增加。(D) 對聚集的紅色熒光進(jìn)行了量化和比較（*=差異明顯，ns=差異不明顯，使用非配對t檢驗，具有單一合并方差）。

結 論

CAR-T靶向熒光素酶報告細胞在測量靶細胞殺傷方面具有優(yōu)勢，無(wú)需使用放射性?¹Cr釋放試驗或預先標記細胞進(jìn)行CAR-T功能評估⁴。

此外，利用細胞形態(tài)學(xué)、生長(cháng)動(dòng)力學(xué)和STR分析對這些報告細胞系進(jìn)行了表征和鑒定⁷。通過(guò)比較低通量和高通量報告細胞，驗證了目標抗原和熒光素酶的表達穩定性。

重要的是，這些熒光素表達細胞的細胞毒性可以通過(guò)實(shí)時(shí)的BLI信號損失來(lái)測量，這種損失通過(guò)活細胞成像和細胞毒性染料吸收試驗得到證實(shí)。綜上所述，特征明確的熒光素酶報告細胞系能夠實(shí)現方便和一致的信號量化，并且它們是研究CAR-T生物功能和驗證用于癌癥免疫治療的新CAR-T藥劑的易用工具。這些強大的細胞模型代表了腫瘤學(xué)研究中最主要的患者來(lái)源的癌和淋巴瘤癌系。

CAR-T靶向熒光素酶報告細胞是從ATCC廣泛的已建立的癌癥細胞系目錄中挑選出來(lái)的，這些細胞系含有一些最普遍的癌癥抗原的高內源性表達，這使得它們成為開(kāi)發(fā)更合適的CAR-T細胞療法的更具生理相關(guān)性的體外工具。

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