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腺相關(guān)病毒（AAV）已成為科學(xué)研究和臨床應用中最受歡迎的病毒工具。AAV可用于在多種細胞中瞬時(shí)表達目的基因。大約50年前，它首次被描述為腺病毒制劑的污染物，因此得名腺相關(guān)病毒（Atchison et al., 1965）。AAV屬于細小病毒科的單鏈DNA病毒。它是由包裝在二十面體衣殼中的“簡(jiǎn)單”基因組構成。它沒(méi)有脂質(zhì)外殼，也稱(chēng)為包膜，因此不能支持向其表面添加糖蛋白，如VSV-G。在研究應用中，通常將基因組去除，以便為基因傳遞提供寶貴的空間并增加安全性。通過(guò)提供編碼復制功能的酶和衣殼蛋白的基因，您可以在組織培養環(huán)境中輕松構建病毒。這使研究人員能夠在受控環(huán)境中產(chǎn)生更多病毒。盡管AAV可從多種生物中分離出來(lái)的，但它與疾病無(wú)關(guān)，它被認為是生物安全1級（BSL1）病毒。

重組AAV (rAAV)工具的優(yōu)化設計

AAV可用于多種應用，包括特定細胞類(lèi)型中的瞬時(shí)基因表達，CRISPR基因組編輯，光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗。如果您不熟悉使用rAAV作為基因傳遞工具，那么在開(kāi)始實(shí)驗之前您應該考慮以下事項：

1、基因載量：即使除去基因組的rAAV也只具有~4.7 kb的基因載量，這是該病毒用于基因載體的關(guān)鍵限制之一。然而，如果您感興趣的基因足夠小，您可以設計單個(gè)rAAV載體，其中包含兩個(gè)基因，并使用IRES或2A等元件用一個(gè)啟動(dòng)子共表達它們。如果滴度很高，不同rAAV的共轉染率也相當高。所以如果不能將兩個(gè)基因同時(shí)放在一個(gè)載體中，您可以考慮共轉染方式（盡管這可能并不總是在體內有效）。

2、特異性：有一些不同的rAAV成分可以驅動(dòng)特定細胞/組織中的基因表達; 這些成分包括啟動(dòng)子，Flp或Cre依賴(lài)性基因開(kāi)關(guān)，以及血清型（血清型將在下面更詳細地討論）。如果您的目標是廣泛表達，那么廣泛活躍的啟動(dòng)子，如CAG（具有CMV即時(shí)早期增強子的雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子），是一個(gè)不錯的選擇。如果您有特定的靶細胞類(lèi)型，您可能想嘗試不同的啟動(dòng)子，例如，CamkIIa具有神經(jīng)元特異性。另一方面，具有Cre或Flp依賴(lài)性基因表達的rAAV載體可以注射到具有在特定細胞類(lèi)型中表達Cre或Flp的動(dòng)物中，導致僅在這些細胞中進(jìn)行基因表達。

3、血清型：衣殼蛋白是rAAV載體非常重要的組分，它可以驅動(dòng)這些載體的生物學(xué)功能。雖然多項研究表明不同的血清型在感染不同類(lèi)型細胞的能力方面存在差異，但最近的一項研究表明，大多數（或所有）血清型使用相同的受體（AAVR）（Pillay et al., 2016）。觀(guān)察到的這種趨向性可能是由于其他因素，例如病毒體附著(zhù)到細胞表面，或者可能是進(jìn)入后的步驟，例如：脫殼。

AAV術(shù)語(yǔ)可能令人困惑。您可能會(huì )看到AAV2/2或AAV2/8等名稱(chēng)，但這些數字實(shí)際上意味著(zhù)什么？第一個(gè)數字代表反向末端重復（ITR）類(lèi)型。ITRs是AAV基因組側端的短DNA序列，允許其在宿主細胞中形成多聯(lián)體。它們與Rep蛋白一起促進(jìn)基因與人類(lèi)基因組在第19號染色體上AAVS1位點(diǎn)的整合，這種情況只能在野生型AAV中觀(guān)察到 - 而不是載體形式。幾乎所有載體都含有2型ITR。2型ITR可以與各種衣殼類(lèi)型一起包裝。用于包裝rAAV載體的衣殼類(lèi)型，即血清型-由第二個(gè)數字表示。例如，如果rAAV載體具有類(lèi)型2的ITR和類(lèi)型8的衣殼，則其將表示為AAV2/8。

4、基因組：野生型AAV是單鏈DNA病毒。在脫殼DNA后，病毒依賴(lài)宿主細胞復制機制來(lái)合成互補DNA鏈。該步驟被認為是rAAV的轉導效率的限制因素。為了克服這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家（McCarty et al）通過(guò)改變一種ITRs來(lái)合成二聚體或自身互補的AAV（稱(chēng)為scAAV）。scAAV載體比ssAAV能更快速起效（幾天）且具有更高水平的轉基因表達。然而，它們的基因載量（<2.5Kb）是ssAAV（<4.8Kb）的一半，這限制了可成功包裝的基因和調控元件的數量。

如果您需要快速轉基因表達，scAAV可能很適用。較低的滴度就可能達到所需的轉基因表達水平，從而減小由于高病毒濃度帶來(lái)的毒性或免疫原性。

Figure 1: Comparison of ssAAV and scAAV genomes, packaging, and transduction. From Takashi Okada (2013). Efficient AAV Vector Production System: Towards Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy, Gene Therapy - Tools and Potential Applications, Dr. Francisco Martin (Ed.), InTech, DOI:10.5772/53023

生產(chǎn)你的rAAV

全世界有幾個(gè)公司，您可以從這些地方獲得優(yōu)質(zhì)，高滴度的rAAV（包括Addgene?。?，當然您也可以使用標準的分子生物學(xué)方法和組織培養經(jīng)驗在您自己的實(shí)驗室中生成rAAV。

簡(jiǎn)而言之，您首先用攜帶目的基因的rAAV載體，腺病毒輔助質(zhì)粒和含有Rep和Cap的質(zhì)粒共轉染HEK293T細胞（圖2，通常稱(chēng)為“三重質(zhì)粒轉染”）。2-3天后，收集上清液（或在某些情況下需要制備細胞提取物，因為一些rAAV血清型被釋放到培養基中，而其他類(lèi)型則沒(méi)有）（Vandenberghe et al），使用PEG從中沉淀病毒粒子。然后使用高速的超速離心機通過(guò)密度梯度離心進(jìn)一步純化病毒顆粒。由于其密度很高，病毒粒子會(huì )在分離液中形成一條帶，你可以收集這條帶。然后通過(guò)透析/緩沖液交換去除密度梯度離心液，并且如果需要可以進(jìn)一步濃縮病毒粒子。

Figure 2: Recombinant AAV (rAAV) transfer vectors typically carry a transgene driven by a promoter of choice between ITRs, but do not encode Rep/Cap. Rep/Cap ORFs encode proteins essential for viral genome replication, virion assembly, and the 60 mer viral capsid. In this case, Rep/Cap are encoded by plasmids that are co-transfected with the transgene plasmid in tissue culture. Also needed for replication is an adenoviral helper plasmid, which induces the lytic life cycle for the AAV, and its release.

體內遞送rAAV

關(guān)于A(yíng)AV在體內的傳遞，有幾個(gè)因素是不同的，這取決于您選擇的生物系統。這些因素對感染的成功程度有很大的影響。無(wú)論您的應用是什么，下面列出的一些參數，您可能需要在注射病毒之前考慮：

1、注射滴度：到達組織的病毒顆粒的數量，將取決于您的病毒制備的滴度和可以遞送的最大體積，并且這些非常重要。不幸的是，如上所述，病毒的滴度不能直接轉化為您在體內觀(guān)察到的現象，盡管它是一個(gè)起點(diǎn)。您可以首先搜索文獻以獲取有關(guān)病毒在特定組織中的建議，但通常需要通過(guò)嘗試一系列稀釋濃度來(lái)確定在體內的最佳劑量。

2、動(dòng)物的年齡：首先，重要的是要記住末期分化細胞（即有絲分裂后期細胞）將具有長(cháng)期A(yíng)AV表達能力，但是在分裂細胞中，表達能力將會(huì )喪失。待注射動(dòng)物的年齡將確定您可以成功感染的細胞類(lèi)型（即在早期發(fā)育時(shí)間點(diǎn)，尚未出生的細胞，即使其有絲分裂祖細胞存在，也不能被AAV感染）（Xiong and Cepko）。

3、感染的可視化：在開(kāi)始感染過(guò)程之前，您還應該考慮如何可視化您的rAAV感染。您是否在rAAV構建體中包含了報告基因，例如GFP或mCherry？能夠通過(guò)熒光測量直接觀(guān)察到病毒表達發(fā)生的位置。如果沒(méi)有，您可以考慮在驅動(dòng)您感興趣的基因的同一啟動(dòng)子下共同注射攜帶報告基因的AAV，并測量報告基因表達作為您感興趣的不易檢測基因的代表。如果無(wú)法進(jìn)行共表達或共感染，通過(guò)免疫組化或原位雜交檢測目的蛋白可能是您最好的選擇。

4、感染后的時(shí)間：注射和組織處理之間需要適當的時(shí)間來(lái)檢測AAV介導的基因表達。時(shí)間將高度取決于衣殼類(lèi)型和您感染的組織。等待~2周是許多組織的較好選擇。據報道，AAV介導的基因表達非常穩定，在人類(lèi)臨床試驗和狗中持續數年（Wonjo et al）。

AAV是用于病毒基因傳遞的極其通用的工具。您特定研究應用的要求將決定AAV設計和遞送的參數。雖然您的最終血清型/滴度/年齡測定將嚴重依賴(lài)于預實(shí)驗，但您可以查看越來(lái)越多的文獻，了解不同生物系統的設計建議方案。在過(guò)去的二十年中，有超過(guò)一百個(gè)涉及AAV的臨床試驗，這個(gè)工具似乎在未來(lái)幾年仍是治療和基礎研究環(huán)境中的熱點(diǎn)。

【參考文獻】

1. Atchison, Robert W., Bruce C. Casto, and William McD Hammon. “Adenovirus-associated defective virus particles.” Science 149.3685 (1965): 754-755. PubMed PMID: 14325163.

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4. Vandenberghe, Luk H., et al. “Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.” Human gene therapy 21.10 (2010): 1251-1257. PubMed PMID: 20649475. PubMed Central PMCID: PMC2957237.

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8. Wojno, Adam P., Eric A. Pierce, and Jean Bennett. “Seeing the light.” Science translational medicine 5.175 (2013): 175fs8-175fs8. PubMed PMID: 23467559.

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