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01支原體簡(jiǎn)介

支原體( Mycoplasma)屬于柔膜體綱，是介于細菌和病毒之間的一類(lèi)無(wú)細胞壁的原核細胞微生物，是已知最小的自我復制的原核生物。能通過(guò)濾菌器，大小為0.1～0.3微米。

支原體廣泛存在于人和動(dòng)物體內，大多不致病，對人致病的支原體主要有肺炎支原體、溶脲脲原體、人型支原體、生殖器支原體等。

支原體是細胞污染物中比較常見(jiàn)的一種，細胞受支原體污染程度較輕時(shí)，不會(huì )表現出明顯的癥狀，可是一旦這種潛伏的污染爆發(fā)時(shí)，細胞會(huì )大量脫落，細胞培養液會(huì )變渾濁。

支原體污染可能來(lái)自操作人員和細胞培養用原材料，如血清和胰蛋白酶，也可能來(lái)自于本身已被污染的細胞系和毒種。細胞受支原體污染后，功能和活性都會(huì )受到影響，會(huì )帶來(lái)不可靠的實(shí)驗結果和不安全的細胞制品，因此對細胞進(jìn)行支原體檢測十分關(guān)鍵。

02支原體檢測相關(guān)法規概覽

支原體檢測屬于監管要求的一部分，支原體檢測方法在全球范圍內的一些藥典、法規和指導文件中均有說(shuō)明。針對生物制藥產(chǎn)品支原體檢測的檢測指導方針包括以下內容：

• 中國藥典2020版三部：生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制

• 中國藥典2020版三部：3301 支原體檢查法

• 歐洲藥典 2.6.7：Mycoplasmas

• 美國藥典 <63>：Mycoplasma Tests

法規要求必須證明用于生物制品生產(chǎn)的細胞基質(zhì)不含外源因子，包括支原體。支原體污染檢測必須在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的各個(gè)階段進(jìn)行，包括原材料、細胞、病毒種子庫、未加工的收獲液材料和最終產(chǎn)品。

ATCC支原體菌株

在中國藥典2020版三部：3301 支原體檢查法中，明確標明了支原體檢測時(shí)使用的菌株為ATCC來(lái)源的菌株，產(chǎn)品信息如下：

03支原體檢測方法

1、分離培養法

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• 分離培養法是支原體檢測的金標方法，其檢測精確度最高；

• 這種方法是從可疑的細胞培養體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(cháng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì )在這種瓊脂平板上瘋狂生長(cháng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。分離培養法基本不會(huì )出現假陰性結果，因此被譽(yù)為支原體檢測金標準；

• 不過(guò)分離培養法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測時(shí)間太長(cháng)，支原體要長(cháng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測絕大多數支原體種類(lèi)，分離培養法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. hyorhinis。

2、DNA檢測（熒光染色）

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• DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養，因此一般需要幾天時(shí)間；

• DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細胞的核周?chē)^(guān)察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒；

• 分離培養法用來(lái)檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準確的將其檢測出來(lái)。

3、PCR法

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• PCR法也可以檢測M. hyorhinis菌株，PCR法檢測支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法；

• 該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過(guò)程中，支原體DNA會(huì )顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測大多數支原體，但謹慎起見(jiàn)最好同時(shí)使用另一種檢測方法來(lái)進(jìn)行驗證。

ATCC廣譜支原體檢測試劑盒：

ATCC廣譜支原體檢測試劑盒---來(lái)自于細胞培養專(zhuān)家ATCC，用PCR方法，對支原體DNA進(jìn)行常規檢測的試劑盒。

這個(gè)試劑盒中包含了可以結合16SrRNA基因的廣譜PCR引物，并通過(guò)降落PCR（touch down PCR）方法提高試劑盒的靈敏度，且用特異性的耐熱DNA聚合酶來(lái)提高試劑盒的特異性。這種方法符合歐洲藥典2.6.7的標準 (Biologicals38,March 2010)

更多產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)品信息可參考ATCC網(wǎng)站：

https://www.atcc.org/search#q=Mycoplasma%20&sort=relevancy&numberOfResults=24

訂購熱線(xiàn)：010-84415766；

郵箱：atcc@sinozhongyuan.com