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研究背景

1、 新生兒真皮黑色素細胞是一個(gè)產(chǎn)生色素的細胞；

2、 皮膚色素沉著(zhù)是一個(gè)多維度且復雜的過(guò)程；黑色素，在黑色素細胞中產(chǎn)生，在黑色素小體中包裝，隨后胞吐到細胞外，接著(zhù)被相鄰的角質(zhì)細胞內吞。

3、 許多基因在不同水平上控制著(zhù)色素沉著(zhù)和黑色素生成中發(fā)揮作用。

4、 這些基因突變是多種皮膚疾病的特征，包括色素沉著(zhù)，色素減退和混合性高/低色素沉著(zhù)。

5、 此外，周?chē)渌逃屑毎置诘耐獠恳蛩匾舱{節著(zhù)黑色素在黑色素細胞中表達。

6、 人類(lèi)原代細胞可以作為闡明黑色素細胞生物學(xué)及其對皮膚制劑毒性的有用模型。然而，原代細胞有其局限性，例如供體的差異性和有限的壽命。因此，研究者需要一個(gè)更強大的人類(lèi)黑色素細胞模型系統，用于研究皮膚色素沉著(zhù)和影響色素沉著(zhù)的因素。

解決方案

根據客戶(hù)需求開(kāi)發(fā)人永生化新生兒皮膚黑色素細胞系：CRL-4064

1、 通過(guò)在原代新生兒皮膚黑色素細胞（ATCC®PCS-200-012™)中插入過(guò)度表達人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）蛋白，建立了人永生化新生兒皮膚黑色素細胞系。

2、 這種新建立的細胞系，可以用作人永生化真皮黑色素細胞系（ATCC®CRL-4059™)體外毒性研究和色素沉著(zhù)調節的細胞模型的補充。

3、 且該新生兒細胞來(lái)自于亞裔供體。

產(chǎn)品信息

黑色素細胞標記物表達

圖1、永生化黑色素細胞均勻表達黑色素細胞特異性標記物TRP1，不表達成纖維細胞特異性標記物TE7。用4%多聚甲醛固定hTERT黑色素細胞，然后在PBS中用0.2%Triton x-100、0.1%吐溫-20和10%正常山羊血清溶液做浸潤封閉。然后細胞在含有0.05%吐溫-20 和2%NGS的PBS溶液中，1:400小鼠抗人的一抗中進(jìn)行染色。之后對細胞進(jìn)行洗滌，然后以1:400稀釋的Alexa fluor 488結合的山羊抗鼠二抗IgG進(jìn)行染色。最后細胞用PBS稀釋的1:5000 Hoechst核染色進(jìn)行復染，并用尼康Ti-eclipse成像倒置顯微鏡和20x物鏡進(jìn)行觀(guān)察。（比例尺為100微米）

細胞形態(tài)

圖2、hTERT永生化新生兒黑色素細胞形態(tài)與典型的黑色素細胞形態(tài)類(lèi)似。用高倍和低倍倒置顯微鏡在10倍物鏡下拍攝貼壁黑色素細胞的融合圖像。（比例尺為82微米）

常見(jiàn)問(wèn)題

Q1、hTERT新生兒黑色素細胞系是如何產(chǎn)生的？

答：CRL-4064是通過(guò)逆轉錄病毒轉導產(chǎn)生的。病毒顆粒是通過(guò)轉染BABE-puro-hTERT質(zhì)粒導入Phoenix AMPHO（CRL-3213）包裝細胞產(chǎn)生的。原代細胞被病毒感染后，接受抗生素加壓選擇，并挑選陽(yáng)性的單細胞克隆。

Q2、永生化是如何確定的？

答：從兩個(gè)方面來(lái)看，壽命測試：該細胞系在35個(gè)群體倍增后，生長(cháng)率沒(méi)有下降，端粒酶也沒(méi)有下降，通過(guò)TRAP（端粒酶重復擴增方法）檢測活性。與CRL-1573陽(yáng)性對照組比較，這些細胞顯示出高的 (≥ 8個(gè)重復DNA單元）端粒酶活性。

Q3、hTERT新生兒黑色素細胞的推薦培養基是什么？

答：該細胞系在真皮細胞基礎培養基（PCS-200-030）中與成人黑色素細胞生長(cháng)試劑盒（PCS-200-042）和0.5微克/毫升嘌呤霉素（維持hTERT表達）中生長(cháng)。

Q4：CRL-4064細胞系的主要用途是什么？

答：CRL-4064旨在替代原代細胞，用于毒理學(xué)或藥物篩選應用，以應對原代細胞在培養中的壽命短暫的問(wèn)題。該細胞也可用于基因調控研究。

Q5、原代黑色素細胞和hTERT黑色素細胞系之間有什么區別？

答：hTERT黑色素細胞繼續分裂，超過(guò)了典型的Hayflick限制的~15個(gè)PDL，在高傳代次數時(shí)，它們甚至沒(méi)有表現出生長(cháng)停滯。ATCC提供了兩種hTERT永生化黑色素細胞系：CRL-4064為新生兒供體的，CRL-4059為成人供體的。