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01 研究背景

免疫檢查點(diǎn)抑制劑最近在肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌和皮膚癌的治療中取得了成功。然而，免疫模型的內在復雜性和不同癌癥類(lèi)型之間對藥物反應的不同，對開(kāi)發(fā)和應用這些新型的免疫療法提出了挑戰。

為了促進(jìn)這種不斷增長(cháng)的免疫調節劑類(lèi)的大規模藥物發(fā)現，研究學(xué)者們對ATCC收藏的大量人類(lèi)腫瘤細胞系和免疫細胞系中已建立和新的免疫檢查點(diǎn)分子進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)譜分析。

基于這些蛋白質(zhì)分析數據，研究學(xué)者們新建了HCC827-GAS-Luc2，一種具有內源性高表達的程序性死亡配體1(PD-L1)的免疫檢查點(diǎn)報告癌細胞系。

該報告細胞系含有一個(gè)γ干擾素激活位點(diǎn)(GAS)---熒光素酶基因上游的應答元件。當癌細胞上的PD-L1與T細胞上的程序性死亡受體-1(PD-1)結合時(shí)，熒光素酶的表達被抑制。在PD-1/PD-L1抑制劑的存在下，HCC827-GAS-Luc2細胞產(chǎn)生基于熒光素酶表達的生物發(fā)光信號，該信號可以很容易地被檢測和量化，以評估該抑制劑的效能、效力和動(dòng)力學(xué)數據。

02 解決思路

癌癥免疫治療已成為許多造血惡性腫瘤的有效治療方法，特別是PD1/PD-L1和CTLA-4阻斷療法。然而，在實(shí)體腫瘤中，該療法成功率明顯較低。

最近的研究表明，在體外和體內，干擾素γ受體(IFN-γR) JAK-STAT信號通路在實(shí)體腫瘤中是T細胞殺死癌細胞所必需的，而在液體腫瘤中非必須。同時(shí)，熒光素酶基因上游含有一個(gè)γ干擾素激活位點(diǎn)(GAS) 應答元件的細胞信號報告系統(如螢火蟲(chóng)熒光素酶；Luc2)被廣泛用于檢測細胞間IFN-γ信號。

圖 1: 作用機理。通過(guò)PD-L1阻斷T細胞活性，HCC827-GAS-Luc2細胞產(chǎn)生熒光素酶信號。Created with BioRender.com。

因此，研究學(xué)者利用已證明的 IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統來(lái)構建一個(gè)實(shí)體腫瘤細胞系，該細胞系能夠穩定地報告活化的CD8+細胞毒性T細胞在殺傷實(shí)體腫瘤細胞過(guò)程中IFN-γ的活性(圖1)。

為了構建這種可靠的實(shí)體腫瘤細胞和細胞毒性T細胞的報告試驗系統，以促進(jìn)癌癥免疫治療藥物的篩選，研究學(xué)者對ATCC提供的50多個(gè)腫瘤細胞株進(jìn)行了基于流式細胞術(shù)的檢查點(diǎn)蛋白譜分析(數據未顯示)。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)結果，HCC827細胞系(ATCC® CRL-2868™)因其高內源性表達PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑而被選擇。

03 新產(chǎn)品的誕生

04 實(shí)驗數據

圖 2: HCC827-GAS-Luc2細胞系評估。用不同的刺激劑評估HCC827-GAS-Luc2細胞信號激活后熒光素酶表達量：(A)IFN-γ刺激(0.01-1000 ng/mL)，(B) 來(lái)著(zhù)未激活和激活的原代CD8+毒性T細胞的條件性檢查點(diǎn)培養基，(C, D)在PD-L1阻斷抗體或同型對照IgG1(1-1000 ng/mL)的存在下與原代人CD8+毒性T細胞共培養。所有實(shí)驗中N=3., P<0.05。

圖3：光鏡下親代HCC827和HCC827-GAS-Luc2的細胞形態(tài)。將細胞保持在A(yíng)TCC推薦的培養條件下，在顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)，并用數碼相機拍攝圖像。

05 結論

基于全面的蛋白質(zhì)組學(xué)數據，研究學(xué)者選擇HCC827---天然高表達PD-L1的實(shí)體腫瘤細胞系來(lái)開(kāi)發(fā)IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統(HCC827-GAS-Luc2細胞系)，該系統能夠可靠地報告活化的原代人CD8+細胞毒性T細胞在殺死癌細胞時(shí)IFN-γ活性。

這種強大的體外免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物測試報告系統是時(shí)間依賴(lài)和細胞數量相關(guān)的，因為隨著(zhù)時(shí)間的推移，CD8+細胞毒性T細胞逐漸殺死所有這些癌細胞，如果有更多的細胞毒性T細胞存在，則可以以更快的速度殺死這些癌細胞。

與市場(chǎng)上其他使用特定免疫檢查點(diǎn)分子異位過(guò)度表達的工程癌細胞系的免疫檢查點(diǎn)分析相比,我們新的免疫檢查點(diǎn)試驗報告系統更具有生理相關(guān)性，因為其自然高表達相關(guān)免疫檢查點(diǎn)分子。

為了最大限度地評估該體系的通用性，研究學(xué)者將IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統加入多種癌細胞中，因此用戶(hù)可以在整個(gè)共培養檢測中使用多種人免疫細胞和對應的癌細胞。例如，可以使用單細胞測序(scRNAseq)新定義的T細胞，CAR-T細胞，B細胞和髓細胞。 

此外，這些細胞可以與其他人類(lèi)腫瘤微環(huán)境細胞(如原代人類(lèi)成纖維細胞和內皮細胞)結合使用，以便更好地模擬在實(shí)體腫瘤微環(huán)境中T細胞介導的癌癥殺傷事件。所有這些細胞組合都是對市場(chǎng)上其他免疫檢查點(diǎn)試驗的改進(jìn)，市場(chǎng)上的信號報告系統僅限于非細胞毒性T細胞株，例如具有NFAT-Luc2報告的CD4+ Jurkat T細胞株。

最后，考慮到最近的研究表明IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT信號在T細胞介導殺傷實(shí)體瘤的癌細胞中的重要性，鑒于現在的實(shí)體瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的成功率明顯偏低，ATCC人癌癥GAS-Luc2報告系統更好地支持了免疫檢查點(diǎn)藥物的發(fā)現和開(kāi)發(fā)。

由于A(yíng)TCC HCC827-GAS-Luc2報告細胞系具有較高的內源性靶標表達、較強的生物熒光信號和檢測活性，是檢測候選PD-1/PD-L1信號檢查點(diǎn)阻滯劑的理想細胞系。