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在細胞世界，細胞通過(guò)冰凍完成了不變和永恒。今天我們就一起來(lái)看看ATCC官方的《動(dòng)物細胞培養指南》中關(guān)于凍存那些事。

低溫儲存綜述

隨著(zhù)細胞被冷凍至冰點(diǎn)以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過(guò)程中，胞內水分可以滲出細胞，則可以減少胞內冰晶。通常1℃/min的降溫速度可以促進(jìn)此過(guò)程。但是，水分的喪失會(huì )導致細胞收縮，當這種收縮達到一定程度，又會(huì )導致細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可以緩解這種效應。細胞凍存的標準程序是在含有冷凍保護劑的培養基中，將細胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉移到液氮中以保持低于–130℃的環(huán)境。

凍存液

5%-10%的甘油和DMSO是最常見(jiàn)的凍存保護劑。雖然DMSO對細胞有毒性，但是與甘油相比，其滲入細胞的速度更快，而且凍存重復性更好（而且細胞復蘇效率更好）。但是，DMSO一方面會(huì )導致某些細胞（如HL-60早幼粒細胞）分化，另一方面對某些細胞（如HBE4-E6/E7肺上皮細胞）的毒性也過(guò)大。對于這些細胞，則應使用甘油。甘油可以通過(guò)高壓蒸汽滅菌，而DMSO只能通過(guò)過(guò)濾除菌。DMSO或者甘油至少應達到試劑級（或者更高級別，如細胞培養級），并且分裝，避光保存。

凍存管

凍存管材質(zhì)分為兩種：玻璃或者塑料。玻璃管更難操作，但更適合珍貴細胞的長(cháng)期保存，而且一旦適當密封，其安全性也更高。

程序降溫盒

有很多方法可以實(shí)現1℃/min的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統是最好的方式，可以精確保持降溫速度。這也是ATCC唯一采用的方法。但這種設備價(jià)格較高，僅當對凍存非常敏感的細胞時(shí)才有必要使用。

比較經(jīng)濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃的冰箱中凍存24小時(shí)。已有一些商業(yè)化凍存盒產(chǎn)品能夠非常接近1℃/min的理想降溫速度?；蛘呖梢詫龃婀芊胖糜诒诤翊蠹s15mm的1L容積的聚苯乙烯盒子中，并填充入紙、棉絨或者泡沫起到隔熱的作用。

液氮罐凍存

長(cháng)期保藏所需要的超低溫（低于 -130℃）環(huán)境，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮儲存分為兩種方式：將凍存管完全浸入液氮中或者懸于液氮液面以上的蒸氣中。液體體系需要更多的液氮，后期維護簡(jiǎn)單，但是液氮有可能進(jìn)入密封不嚴的凍存管中，并在細胞復蘇時(shí)發(fā)生凍存管爆炸。

因此，ATCC強烈建議保存在液氮蒸氣中。液氮蒸氣會(huì )在罐內產(chǎn)生一個(gè)垂直的溫度梯度。液氮底層為-196℃，而上層溫度會(huì )受到液氮余量和液氮罐敞開(kāi)時(shí)長(cháng)的影響。為保證儲存安全，請確保罐中液氮充足，以使上層溫度低于-130℃。所有的儲存系統都應配備溫度報警裝置。

凍存程序

以下程序適用于大多數細胞，如果必要，可以適當調整。凍存培養基的配方請參考其細胞說(shuō)明書(shū)。

1.凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體和病毒的污染。通常凍存后10-14天才能得到污染檢測結果，如果確定有污染，應將該細胞銷(xiāo)毀。

2.凍存培養基由完全培養基和5% DMSO（ATCC No. 4-X）組成。由于DMSO的溶解會(huì )放熱，所以不能向細胞懸液中直接加入未稀釋的DMSO。

3.以溫和速度（125g×10 min）離心收集細胞，并以1×10*6-5×10*6活細胞/ml的密度重懸細胞。繼續培養細胞直到復蘇后細胞活性得以確定。

4.在凍存管上標記好細胞名稱(chēng)，編號和凍存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml細胞懸液（視凍存管體積）并密封。

5.室溫條件下，將細胞在凍存培養基中平衡15-40 min（勿超）。這段時(shí)間中，可以將細胞懸液等分加入凍存管中。40min后，細胞活性可能會(huì )受到DMSO的影響而下降。

6.將凍存管置于已預冷至4℃的程序降溫盒，并將降溫盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少24小時(shí)?；蛘?，使用已預冷至4℃的可編程電子降溫系統以1℃/min的速度將凍存管降溫至-40℃以下，然后迅速降至-130℃。

7.將凍存管迅速轉移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷凍的細胞會(huì )以10℃/min的速度升溫，一旦達到-50℃以上，細胞會(huì )劇烈受損。

8.記錄凍存位置和過(guò)程細節等信息。

9.置于-130℃ 24小時(shí)后，取出一只凍存管并復蘇，以測定細胞活性和是否污染。

凍存細胞復蘇

應以最快速度融化凍存的細胞溶液，然后迅速與完全培養基混合，并接種到合適的細胞瓶中。雖然單層培養的細胞可以從多孔板中復蘇，但其復蘇狀態(tài)和細胞培養瓶并不一致。

雜交瘤等某些細胞系的完全復蘇時(shí)間可能需要幾天。在復蘇的第一天，某些雜交瘤細胞活性較差且會(huì )產(chǎn)生細胞碎片。復蘇時(shí)，多數細胞都會(huì )出現活性下降的現象，并在融化后24小時(shí)達到活性最低值。即使不是全部，這種活性下降的多數情況可能是由凍存過(guò)程中壓力變化誘導的凋亡導致的。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，細胞開(kāi)始恢復并進(jìn)入指數生長(cháng)期。

1.準備細胞培養容器（如T-75細胞瓶），加入至少10 ml適當的培養基，并平衡溫度及pH。

2.從液氮罐中取出凍存管，并在37℃（或適合該細胞的溫度）水浴中緩慢搖動(dòng)至冰晶徹底融化（約2 min），注意解凍過(guò)程要迅速。

3.從水浴中取出凍存管，浸泡入或者噴涂酒精消毒。后續的操作，需在無(wú)菌操作臺中，并保證嚴格無(wú)菌。

4.擰開(kāi)凍存管蓋，將細胞懸液轉移至含有9 ml完全培養基的無(wú)菌離心管中。溫和離心(125g×10min)，棄去上清即凍存保護劑，注意不要擾動(dòng)細胞層，加入1-2 ml完全培養基重懸細胞。緩慢吹打使細胞團變松散（如果細胞成簇生長(cháng)，則不要過(guò)分吹打）。將細胞懸液轉移至含培養基的容器中充分混合。

5.24小時(shí)后，檢測細胞狀態(tài)。如果需要，可以進(jìn)行傳代。