當我們歷經(jīng)種種挑戰獲得實(shí)驗結果，經(jīng)常會(huì )發(fā)出疑問(wèn)三連：

• 我的實(shí)驗結果是不是準確？
• 我的結果是否出現假陽(yáng)性或假陰性？
• 結果的差異是不是因實(shí)驗設計中的變量造成的？

要回答這些問(wèn)題，合適的對照樣品就成了不可或缺的一環(huán)。

一、陰性對照與陽(yáng)性對照

• Western Blot 實(shí)驗結果有雜帶？
• IHC 實(shí)驗沒(méi)有陽(yáng)性信號？
• 目的蛋白表達定位與文獻報道的有出入怎么辦？

要回答這些問(wèn)題，就需要在實(shí)驗中設置陰性或陽(yáng)性對照。

陽(yáng)性對照品一般會(huì )使用文獻或數據庫中報道的高表達目的蛋白的組織或細胞。陽(yáng)性對照確保了實(shí)驗的靈敏度，也保證了實(shí)驗過(guò)程中抗原抗體的結合效率。

陰性對照品一般會(huì )使用或文獻或數據庫中報道的低表達目的蛋白的組織或細胞，使用敲低或敲除目的基因的樣本。在 IHC/ICC 實(shí)驗中，也可以用 PBS 或同型對照代替一抗。陰性對照確保了實(shí)驗的特異性，排除非特異性信號對結果造成的干擾。

接下來(lái)，我們舉個(gè)例子：

比如用二乙基亞硝胺誘導小鼠肝纖維化，常常用 Alpha-SMA 作為肝纖維化的標志物。在進(jìn)行 IHC 實(shí)驗時(shí)，為了保證陽(yáng)性信號的可靠性，就需要平行加一個(gè)胃或結腸組織的樣本作為對照。因為，Alpha-SMA 會(huì )特異性的表達在平滑肌細胞，而黏膜細胞無(wú)表達。

圖片來(lái)源：W Li et al. Cell Death Dis (2019).

如上圖的所示，胃平滑肌層陽(yáng)性信號明顯，黏膜層無(wú)陽(yáng)性信號，證明抗體得到的信號是敏感且特異的（Alpha-SMA，貨號 NBP2-33006）。

二、同型對照

這個(gè)概念，相信深諳流式細胞技術(shù)的小伙伴都耳熟能詳。因為抗體本身的特殊功能，特別是抗體 IgG Fc 段與細胞的 Fc 受體結合的能力，會(huì )使實(shí)驗結果的非特異性信號加強。

同時(shí)，在一些抗體的功能性實(shí)驗，比如中和實(shí)驗和封閉實(shí)驗中，也會(huì )對細胞（尤其是免疫細胞）的生理功能產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而導致實(shí)驗結果與預期或文獻報道不相符。

抗體結構與抗體類(lèi)型示意圖

這時(shí)，同型對照就是必不可少的工具：

同型對照是陰性對照的一種，是利用與實(shí)驗抗體同亞型的免疫球蛋白，排除實(shí)驗本底信號的工具。廣泛運用在免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)、抗體封閉中和實(shí)驗等一些以抗原-抗體結合為基礎的實(shí)驗中。

同型對照需要選用與目標抗體相同種屬來(lái)源、相同的免疫球蛋白類(lèi)型及亞型的抗體。如果是應用在流式細胞術(shù)，還需要標記相同的熒光素。我們通常建議選用來(lái)自與特異熒光抗體相同生產(chǎn)廠(chǎng)家的同型對照抗體, 因為其生產(chǎn)工藝、熒光蛋白比值以及標記工藝都是相同的。

比如：

用  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody（貨號 FAB1300P）檢測 K562  細胞表面的 MICA，因為該抗體的種屬來(lái)源是小鼠，免疫球蛋白是 IgG，亞型是 2B，標記的熒光素是 PE，所以，我們使用的同型對照應該是 Mouse IgG2B PE 抗體（貨號 IC0041P）。

如上圖，左邊藍色的峰為同型對照，右邊橙色的峰為 MICA 特異性的 PE 信號峰。有了同型對照，自然就能分辨出合適的陽(yáng)性熒光強度，為之后設門(mén)和進(jìn)一步分析打下可靠的基礎。

設置合適的對照就像給實(shí)驗加上一層保險，保證了實(shí)驗結果的可靠性，也為后續實(shí)驗的優(yōu)化及 trouble shooting 提供了重要的線(xiàn)索。

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