據報道，目前每年都會(huì )有20%的人感染流感病毒，接種流感疫苗是抵御病毒的有效防范措施。

傳統的流感疫苗采用將流感病毒株接種到雞胚，經(jīng)培養、收獲病毒液，病毒滅活、純化等步驟制成。這種工藝路線(xiàn)成本相對較高，而且污染微生物的風(fēng)險較高，對接種者有可能引起過(guò)敏反應。因而，利用哺乳動(dòng)物細胞作為細胞基質(zhì)生產(chǎn)疫苗是另外一種選擇，有利于迅速實(shí)現規?；a(chǎn)。

2012年，美國FDA批準Flucelvax作為第一個(gè)哺乳動(dòng)物細胞（MDCK）生產(chǎn)的美國流感疫苗。

對于疫苗生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，如何優(yōu)化工藝，最大程度的提高產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，一直是永恒的話(huà)題。除了優(yōu)化下游的步驟，是否有可能從上游細胞入手，通過(guò)改變關(guān)鍵基因獲得產(chǎn)病毒能力更高的MDCK細胞株？

ATCC把目標鎖定在了STAT1基因。

STAT1蛋白是細胞干擾素抗病毒應答的重要分子。ATCC通過(guò)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功敲除MDCK STAT1基因，開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的細胞模型MDCK.STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG)。

實(shí)驗證明基因編輯后的細胞沒(méi)有STAT1蛋白表達，與親本細胞系相比，病毒產(chǎn)生能力明顯增加，接種甲型流感（H1N1；ATCC®VR-1736™)后，病毒滴度提高了30倍。

圖1. 甲型流感（H1N1；ATCC®VR-1736™) 接種 STAT1-KO-MDCK 細胞實(shí)驗結果。（A）MDCK WT 親本和 MDCK.STAT1 型 KO 細胞，接種甲型流感，48小時(shí)后收集細胞上清液。綠色-抗流感病毒染色，藍色-核染色。（B）感染甲型流感病毒48小時(shí)后細胞上清液的TCID50值。（C） RT-PCR法定量檢測感染48小時(shí)后甲型流感病毒基因組拷貝數。

圖2. STAT1-KO-MDCK 細胞特征。（A）MDCK.STAT1KO 細胞 STAT1 基因測序結果證實(shí)STAT1基因斷裂。（B）測序結果顯示，MDCK.STAT1KO 細胞是一個(gè)雜合子。一條等位基因存在單一堿基插入，另一個(gè)等位基因存在4堿基的缺失。（C）WB結果顯示，無(wú)論是低代次還是高代次， MDCK.STAT1KO 細胞都沒(méi)有 STAT1  蛋白表達。

圖3. STAT1-KO-MDCK 細胞無(wú) Cas9/CMV 基因序列的整合。

圖4. STAT1-KO-MDCK 細胞，未發(fā)現脫靶效應導致的非靶向突變。

改良后的MDCK細胞（MDCK.STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG)）大大提高了病毒生產(chǎn)滴度，穩定的STAT1敲除基因型，無(wú)Cas9/CMV 基因序列的整合，無(wú)脫靶導致的突變。以上特征使得該細胞成為基礎研究、病毒疫苗生產(chǎn)的一個(gè)優(yōu)質(zhì)細胞模型。