實(shí)驗的每一小步，都是決定結果的一大步。本期將為大家講解IHC/ICC實(shí)驗中檢測和顯像的方法，喜歡的話(huà)就繼續往下看吧！

與一抗孵育之后，可利用適當的檢測系統來(lái)觀(guān)察抗體結合。檢測方法可以是直接的，也可以是間接的，產(chǎn)生熒光或顯色信號。直接檢測涉及到與標記直接結合的一抗的使用。間接檢測方法則利用標記由一抗的宿主物種中產(chǎn)生的二抗。間接方法還包括放大步驟，以增強信號強度。觀(guān)察表位-抗體相互作用的常用標記包括一些熒光基團和酶，這些酶將可溶的底物轉化成不可溶、顯色的終產(chǎn)物。標記的選擇受到檢測方法、個(gè)人偏好以及可用的顯微鏡設備的影響。

直接或間接檢測，信號放大

選擇直接檢測還是間接檢測，這常常取決于抗原的表達水平。例如，高表達表位的檢測可通過(guò)與標記直接結合的一抗來(lái)實(shí)現。直接檢測的優(yōu)點(diǎn)包括多色染色更為簡(jiǎn)單，且沒(méi)有二抗非特異結合的顧慮。主要缺點(diǎn)在于直接檢測達不到觀(guān)察較低表達水平的靈敏度。在極少數情況下標記過(guò)程可能會(huì )對一抗的親和力產(chǎn)生不良影響。

相比之下，間接檢測方法通常有著(zhù)更高水平的靈敏度，并產(chǎn)生更強烈的信號。信號經(jīng)過(guò)間接方法放大，因為至少有兩個(gè)標記的二抗與每個(gè)一抗結合。不過(guò)，二抗的使用需要額外的封閉步驟和對照。

利用親和素和鏈霉親和素與生物素的強親和力，可實(shí)現信號的進(jìn)一步放大。親和素是一種存在于蛋清中的糖蛋白，按化學(xué)計量與生物素結合。鏈霉親和素純化自鏈霉菌 Streptomyces avidinii ，未糖基化，表現出比親和素更低的非特異結合。兩種蛋白的每個(gè)分子都結合四個(gè)生物素。如果采用生物素化的二抗，那么通過(guò)與親和素-生物素（ABC方法）或標記的鏈霉親和素-生物素（LSAB 方法）的孵育可明顯放大信號。鏈霉親和素可與檢測酶（辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）或熒光染料結合。使用這些放大方法需要額外的步驟來(lái)防止非特異結合。

檢測方法與信號強度

熒光檢測

熒光檢測是基于熒光色素的使用，它們在受到較短波長(cháng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)光。熒光色素可直接與一抗或二抗結合，或與鏈霉親和素結合。免疫熒光常用于多個(gè)細胞目標的同時(shí)觀(guān)察。例如，組織可與不同的一抗混合物孵育，再與結合有熒光色素的二抗孵育，這些熒光染料在不同波長(cháng)下發(fā)光。

多色實(shí)驗必須經(jīng)過(guò)設計，以限制檢測試劑之間的交叉反應性，以及所使用的熒光染料在光譜性質(zhì)上的交叉。為了限制二抗之間的交叉反應性，一抗應來(lái)自不同的物種。這樣就能使用物種特異的二抗，分別只識別一個(gè)一抗。不過(guò)，也有一些情況，需要同時(shí)使用同一個(gè)物種的抗體。這可通過(guò)使用一個(gè)生物素化的一抗來(lái)實(shí)現。在使用這種技術(shù)時(shí)組織必須先與非生物素化的抗體孵育，再與熒光基團結合的二抗孵育。之后將組織與生物素化的一抗孵育，再與鏈霉親和素結合的熒光色素孵育。這種方法確保鏈霉親和素結合物只與生物素化的抗體結合，限制了交叉反應性。

多色熒光顯微鏡。典型的免疫熒光設置包括光源、適合目的熒光染料的濾光片組合，以及檢測機制。

R&D Systems的 NorthernLights 熒光色素有著(zhù)不重疊的光譜性質(zhì)，非常適合多色IHC和ICC。A. NorthernLights-493 anti-goat igG（貨號 NL003：綠色）和 NorthernLights-557 anti-mouse IgG（貨號 NL007：紅色）的發(fā)射曲線(xiàn)。B. 利用 anti-rat Nestin 親和純化的多克隆抗體（貨號 AF2736：綠色）和 anti-neuron specific beta-III Tubulin 單克隆抗體（克隆號 TUJ-1）（貨號 MAB1195：紅色）多色檢測大鼠皮層干細胞中的 Nestin和 beta-III Tubulin。細胞經(jīng)過(guò)NorthernLights-493（貨號 NL003：綠色）和 NorthernLights-557（貨號 NL007：紅色）二抗染色，并經(jīng) DAPI（藍色）復染。

顯色檢測

為了方便顯色檢測，一抗、二抗或鏈霉親和素可與酶結合。在加入可溶的有機底物時(shí)，酶與底物反應，產(chǎn)生不溶的有色產(chǎn)物，沉積在抗原表達的位置。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶，它們分別將3,3' 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）轉化成棕色和紅色的終產(chǎn)物。DAB比AEC 更常用，因為后者易溶于酒精，且暴露在過(guò)度光照下時(shí)更容易褪色。在使用 AEC 時(shí)必須用水性的復染劑和封片劑。

通常認為顯色檢測比免疫熒光更為靈敏，但沒(méi)那么方便，因為孵育和封閉步驟更多。與免疫熒光相似，顯色檢測也允許多個(gè)抗原的觀(guān)察，但這些抗原只能在細胞和組織的不同位置，因為重疊的顏色可能會(huì )使結果難以解釋。DAB顯色檢測的好處在于，HRP和DAB發(fā)生反應生成的有色沉淀物對光不敏感，玻片可保存數年。與需要專(zhuān)門(mén)光源和濾光片組合的熒光顯微鏡不同，顯色技術(shù)只需要一般的光學(xué)顯微鏡。

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