實(shí)驗的每一小步，都是決定結果的一大步。本期將為大家講解IHC/ICC實(shí)驗中固定步驟的要點(diǎn)，喜歡的話(huà)就繼續往下看吧！

固定

IHC和ICC實(shí)驗中所有樣品都必須固定，以保護組織形態(tài)和目標分子的抗原性。固定會(huì )改變組織的化學(xué)組成，在保護組織結構和維持抗原表位之間常常需要進(jìn)行權衡。細胞或組織固定不充分給蛋白在組織內快速降解留下了機會(huì )，這會(huì )影響特異性的免疫反應。然而，過(guò)度固定會(huì )遮蔽抗原表位或導致很強的非特異性的背景染色，掩蓋特異性染色。固定的方法和順序必須在樣品準備的時(shí)候考慮到，另外，時(shí)間、溫度和pH值也會(huì )影響固定的程度。

1.甲醛

甲醛是用于保存組織和細胞中目標蛋白的最常用的固定劑。一般認為甲醛介導的組織固定取決于蛋白和蛋白或蛋白和核酸之間的亞甲基(-CH₂-)交聯(lián)的形成。甲醛可以將NH₂(氨基)和CONH(肽基)、NH₂和NH或NH₂和NH₂化學(xué)交聯(lián)在一起。

對于大多數IHC/ICC應用來(lái)說(shuō)甲醛是個(gè)不錯的選擇，但并不是通用的固定劑。甲醛的過(guò)度固定會(huì )改變抗原表位中的氨基酸并阻止抗體的結合。不過(guò)，大多數情況下可以使用抗原修復試劑修復抗原的表位并恢復和抗體的結合。甲醛會(huì )導致磷酸依賴(lài)型的表位從膜轉移到胞質(zhì)溶膠中。在這種情況下，冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇則是合適的固定劑。

抗原修復液

注意：雖然有許多種不同的固定劑，甲醛仍然是最常用，并且對于大多數IHC/ICC實(shí)驗來(lái)說(shuō)是合適的初始選擇。甲醛溶液應當分裝并冷凍保存，在4-8℃下儲存不超過(guò)一個(gè)月。

2.醇

細胞和組織固定最常用的醇類(lèi)是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子結構和水很接近。因此，它們能夠和水競爭蛋白質(zhì)中的氫鍵，替代組織中的水分子。這會(huì )減少蛋白質(zhì)的介電常數，使其在等電點(diǎn)處沉淀，并且由于蛋白構象的變化，這會(huì )阻止抗體和其表位的結合。雖然醇會(huì )破壞蛋白質(zhì)的疏水相互作用并影響到其三級結構，卻似乎能夠穩定蛋白質(zhì)的二級結構。

然而，通常認為醇對組織形態(tài)的保護不如甲醛類(lèi)固定劑。醇的穿透能力不如甲醛，主要用于固定冰凍組織切片和細胞。因此，醇固定更適合于細胞膜表面抗原。醇固定之后不建議進(jìn)行抗原修復，因為通常認為這樣的處理太劇烈，很有可能破壞組織切片或細胞的完整性。

3.丙酮

丙酮是強脫水劑，會(huì )引起組織蛋白的不可逆沉淀，通常用于未固定的速凍組織，丙酮處理之后再用醇或甲醛固定。

4.組織固定

當研究小動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整組織時(shí)，全動(dòng)物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法。這種方法是用固定劑來(lái)替代動(dòng)物全身的血液。但是，對于所感興趣的組織的固定，動(dòng)物灌流不一定充分。在這種情況下，可以將剝離出來(lái)的組織浸泡在固定劑中。PBS溶解的4%的甲醛是組織的灌流和浸潤固定的常用溶劑。

為了增強固定劑的穿透作用，組織最好不要超過(guò)10mm厚。對于完全固定，固定劑的體積應當超過(guò)組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進(jìn)行4-24小時(shí)。固定條件的優(yōu)化非常重要，因為固定不足或過(guò)度固定都會(huì )減少或破壞組織的免疫反應。

5.細胞固定

與組織樣品相比，細胞的固定所需時(shí)間更短，可以使用濃度更低的固定劑。例如，用2%的甲醛溶液在室溫下固定20分鐘就足以保存細胞形態(tài)和抗原性。

細胞的固定通常就只需要去掉培養基并加入固定劑。然而，去除培養基之后表面張力的變化會(huì )破壞某些類(lèi)型的細胞。如果這樣的話(huà)，可以在培養基中直接加入固定劑。例如加入和培養基等體積的4%的甲醛即得到2%的甲醛溶液，足以對細胞進(jìn)行預固定。兩分鐘后，換掉預固定培養基，加入新鮮的2%的固定劑。預固定的處理使細胞更加堅固，可以承受表面張力的變化造成的破壞性效果。

注意：固定會(huì )導致組織蛋白的疏水性交聯(lián)。交聯(lián)的程度取決于時(shí)間、溫度、pH和所用的固定別。一旦固定方案經(jīng)過(guò)優(yōu)化,應當保持操作的致性。

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