Western Blotting即免疫印跡實(shí)驗，用于蛋白質(zhì)的定性分析，同時(shí)能夠粗略的估計蛋白質(zhì)的分子量大小，可謂生物實(shí)驗的必備技能，傳統的Western實(shí)驗流程包括轉膜、一抗雜交、二抗雜交、顯色。根據二抗標記的不同可分為酶標二抗和熒光二抗，常見(jiàn)的用于標記二抗的兩種酶是HRP辣根過(guò)氧化物酶和AP堿性磷酸酶，熒光二抗一般多用Cy3或者Cy5標記。
 

HRP標記時(shí)顯色多用ECL試劑，即底物魯米諾和過(guò)氧化氫，HRP催化魯米諾產(chǎn)生多步氧化反應，使之從基態(tài)躍升至激發(fā)態(tài)并伴隨產(chǎn)生428nm的低強度發(fā)射光，可以利用CCD或膠片進(jìn)行檢測，ECL檢測靈敏度極高，目前多個(gè)廠(chǎng)商正在挑戰fg級別。另外有小伙伴會(huì )問(wèn)DAB也可用于HRP標記的顯色，為什么應用在Western里面很少呢？盡管DAB顯色可以產(chǎn)生棕紅色的可見(jiàn)條帶非常利于觀(guān)察，但是DAB顯色靈敏度較低，對底物的量要求在500pg以上，所以多用于組化顯色。還有一種AP堿性磷酸酶標記的二抗多用BCIP/NBT試劑盒進(jìn)行顯色，BCIP在堿性磷酸酶的作用下水解，水解產(chǎn)物和NBT發(fā)生反應產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的不溶物，形成有顏色條帶，加水后可以終止反應（小編依然清楚的記得第一次做AP顯色看到條帶時(shí)激動(dòng)的拿著(zhù)洗瓶揮舞的自我），BCIP/NBT顯色靈敏度在100pg左右。這下知道為什么大多的客戶(hù)都選擇ECL顯色了吧，畢竟高豐度的蛋白沒(méi)那么多哦。

熒光二抗用起來(lái)就非常方便了，二抗上直接帶標記，所以直接拿去曝光顯色，一張膜可以同時(shí)雜兩個(gè)抗體，不用為內參而裁膜的感覺(jué)真好。

2019年的第一個(gè)心愿就是把2018年沒(méi)有解決的，本該在2017年就該完成的Western實(shí)驗解決掉。本期內容要幫助大家把Western這個(gè)實(shí)驗的坑填一填，那就從轉膜開(kāi)始吧！

1、轉 膜

1. PVDF膜和NC膜區別在哪？

答：通常，PVDF膜蛋白吸附能力強，而NC膜背景更干凈；PVDF膜由于疏水等原因，所以使用前需要100%甲醇浸潤；NC膜使用方便但比較脆。如果蛋白豐度較低，推薦使用PVDF膜。

2. 膜有多種孔徑，該如何選擇？

答：最常用的膜孔徑是0.45 μm，適合檢測分子量>20kDa的蛋白。0.2 μm 孔徑適合檢測10-20kDa之間的蛋白。0.1 μm 孔徑適合檢測<10kDa的蛋白。

3. PVDF膜可以反復雜交么？

答：對于PVDF膜上的大部分蛋白，在stripping后重新封閉雜交，仍然能夠進(jìn)行顯色出條帶。

4. 濕轉和半干轉如何選擇？

答：半干轉時(shí)間短速度快，試劑耗費少，但前期需要幾次的摸索，且不同的半干轉印儀器轉印條件相差較多。濕轉成功率高，但相對費時(shí)，可根據實(shí)驗條件和個(gè)人喜好來(lái)選擇合適的方案。

2、封 閉

1. 選擇脫脂奶粉還是BSA？

答：通常，磷酸化蛋白的檢測使用BSA進(jìn)行封閉，普通蛋白脫脂奶粉即可，盡量選擇高品質(zhì)的脫脂奶粉，減少抗體淬滅及非特異條帶。

2. 封閉失敗案例！

答：剛參加工作的時(shí)候，接到客戶(hù)電話(huà)說(shuō)顯色沒(méi)條帶，一直都在幫客戶(hù)排查樣品和抗體的問(wèn)題，一直未解決，直到一日翻看客戶(hù)發(fā)過(guò)來(lái)的圖片，發(fā)現5%脫脂奶粉的玻璃瓶里微微發(fā)綠（其實(shí)就是長(cháng)菌了）。猜想客戶(hù)是配了一瓶奶粉放冰箱里，隨用隨??？果不其然，客戶(hù)說(shuō)一直都是這樣做的啊，以前的蛋白條帶都沒(méi)問(wèn)題。小編當時(shí)差點(diǎn)一口老血噴出一丈遠，親，咱不差這點(diǎn)奶粉，長(cháng)菌了就不要再用了！

3、一 抗

1. 一抗選擇的時(shí)候注意哪些問(wèn)題？

答：通常，優(yōu)先選擇單克隆抗體，非特異性條帶少。除少量標簽抗體外，務(wù)必注意物種特異性，盡量選擇文獻中使用較多的抗體。

2. WB的一抗為何很少有直接帶HRP標記的呢？

答：首先由于一抗生產(chǎn)周期較長(cháng)，成本較高，利用化學(xué)反應標記基團損失大量抗體的同時(shí)會(huì )降低抗體的親和力，其次樣品中目標條帶的量較少，所以一抗結合后信號強度較低，顯色時(shí)條帶很弱。而流式抗體直標較多，且標記的熒光基團信號如FITC，PE等，其信號強度大且易于檢測。

4、二 抗

1. 二抗選擇的時(shí)候注意哪些問(wèn)題？

答：通常，二抗選擇首要問(wèn)題是種屬特異性，一抗如果是兔抗，那么二抗可以選擇羊抗兔，鼠抗兔等。選擇親緣性較遠的種屬，能夠顯著(zhù)提高特異性。

2. 二抗的主要作用是？

答：結合一抗的同時(shí)，把一抗信號級聯(lián)放大很多倍，并且二抗上帶有HRP等標記，可以進(jìn)行顯色反應。把微弱的信號放大到可供檢測的范圍內。二抗一般結合在一抗的FC區，不會(huì )競爭性的結合在一抗的V區。

5、顯 色

1. 顯色液如何使用和保存？

答：通常將AB液充分混合后，按照膜面積進(jìn)行配置，注意效期避光保存。

2. 顯色沒(méi)條帶怎么辦？

答：在確定樣品，抗體等均無(wú)問(wèn)題后，選擇靈敏度高的顯色液，fg級別的顯色液能夠針對低豐度的蛋白進(jìn)行有效顯色。

文中圖片來(lái)源：GE官網(wǎng)

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