實(shí)驗室玄學(xué)千千萬(wàn)，預測和結果不符占一半。

WB實(shí)驗是各位小伙伴們，時(shí)常光顧的一個(gè)實(shí)驗。但就是這樣一個(gè)初級又常用的實(shí)驗，卻會(huì )出現各種稀奇古怪的問(wèn)題。

怎么我的條帶每次都不一樣！

比如在WB實(shí)驗鑒定蛋白時(shí)，我們得到的蛋白質(zhì)條帶大小常常會(huì )和預測值有所偏差。這是身患“強迫癥”的小伙伴們不能忍的。

猛男落淚，誰(shuí)來(lái)看看到底問(wèn)題在哪里？

如果是實(shí)驗出錯或者預測不準這種情況，小編是沒(méi)辦法跳出手機屏幕救你了。

但這下面的5條準則，小伙伴們倒是可以珍藏一下，在遇到蛋白質(zhì)條帶大小和預測值偏差的時(shí)候，拿出來(lái)分析一下。

我們可以對照著(zhù)這張圖來(lái)看原因。

下面小編就來(lái)詳細地講解一下這5條具體是個(gè)啥。

當我們做WB實(shí)驗鑒定蛋白的時(shí)候，最喜歡看到的是這樣的條帶：

但通常，自己做出來(lái)的，就會(huì )變成這樣：

是生活對我們這些實(shí)驗小可愛(ài)下手了嗎？

還是水逆沒(méi)過(guò)去？

為什么 WB 跑了這么多次，

都和預測差了這么多？ 

當然不是那些玄學(xué)原因啦。讓我們科學(xué)地分析一下到底是哪里出了問(wèn)題。

 內源性蛋白 or 重組蛋白

查問(wèn)題要從源頭查起，所以各位小伙伴們要先看一看樣品是內源性蛋白還是重組蛋白？

如果是內源性蛋白還不打緊，如果是重組蛋白，那么馬上就要看一看重組蛋白是否為全長(cháng)序列了。假如樣品是重組蛋白，還不是全長(cháng)序列，那么條帶大小一定會(huì )和預測大小不一致。

多個(gè) isoform 辨仔細

如果確定了樣品是內源蛋白，那就要看看我們的目標蛋白是不是有其他的 isoform，這個(gè)我們通常會(huì )去查看NCBI或者SWISSPROT來(lái)確認。

 SWISSPROT 會(huì )標出有些基因有多種 isoform

做著(zhù)實(shí)驗，結果換了別的 isoform 可就一頓瞎忙活啦。

剪切活化要注意

如果在 SWISSPROT 或者權威的文獻里提到了，樣品的這個(gè)蛋白需要剪切活化，那么結果又要和預測值不同啦。

成倍增長(cháng)多聚體

如果蛋白大小和預測值有明顯倍數關(guān)系，那就要考慮一下這個(gè)蛋白是不是二聚體或者多聚體啦。

蛋白修飾要變大

如果排除了以上4條原因，預測值和實(shí)驗結果不一致，那就是因為我們面對的蛋白質(zhì)，是個(gè)善變的對象，它不僅會(huì )剪切活化，還有在翻譯表達后修飾。

比如：比如甲基化、乙?；?、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、異戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巰基乙胺基化……balabala。

在不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)還會(huì )有不同的修飾。加入了官能團肯定會(huì )讓蛋白質(zhì)比預測值偏大。在日常的實(shí)驗中，糖基化是比較常見(jiàn)的修飾，一般會(huì )導致跑出來(lái)的條帶比預測值大那么一些。

SWISSPROT 會(huì )給出蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)信息，各個(gè)都有支持依據哦~

讓小編最后再總結一下。

當WB大小和預測值不一致時(shí)

● 確定蛋白是內源的還是外源的，如果是外源蛋白是不是全長(cháng)序列；

● SWISSPROT數據庫查詢(xún)該蛋白是否有其他isoform；

● SWISSPROT和文獻查詢(xún)蛋白質(zhì)是否有剪切活化，剪切活化造成蛋白變??；

● 確定蛋白質(zhì)是否是二聚體或多聚體。

● NCBI和SWISSPROT查詢(xún)蛋白質(zhì)表達后是否有修飾，如有修飾會(huì )導致蛋白質(zhì)增大；

以上就是小編給出的 5 條小貼士，拿去分析下自己的條帶問(wèn)題絕對是綽綽有余了。如果用過(guò)了這 5 條，還是沒(méi)找到問(wèn)題在哪里，那就要回過(guò)頭看看是不是預測不準或者實(shí)驗出錯啦。

本文轉自Abcam微信公眾號。

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