自噬是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這就為其定量檢測帶來(lái)困難。傳統方法利用電子顯微鏡對自噬過(guò)程進(jìn)行研究。自噬相關(guān)蛋白的發(fā)現和表征促進(jìn)了鑒別和量化自噬活性的分子工具和方法的發(fā)展。理想情況下，應該使用組合測量方法，使用包括穩態(tài)和自噬流測定等來(lái)評估不同體系的自噬活動(dòng)。

這是一份來(lái)自官方的檢測操作指南，重要性你懂得~

穩態(tài)分析實(shí)驗:自噬小體數量

自噬小體的數量分析實(shí)驗通常測定的是LC3蛋白。LC3存在于胞質(zhì)和核室中。脂化型或LC3 - II是已知的唯一與自噬小體內膜相關(guān)的蛋白。免疫熒(ICC/IHC/IF)和免疫印記(WB)可以檢測LC3-II水平，通過(guò)它可以較好地評估自噬小體的數量。有超過(guò)500篇文獻顯示:我們的LC3B抗體(產(chǎn)品編號#NB100-2220)是被廣泛信任和使用的可以檢測LC3水平的抗體。

LC3-II 斑點(diǎn)實(shí)驗(ICC /IHC/ IF)

該方法結合使用LC3抗體與熒光顯微鏡來(lái)定量檢測熒光斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)的數量和自噬小體的數量相關(guān)。這個(gè)實(shí)驗可以得知每個(gè)細胞的斑點(diǎn)數或有斑點(diǎn)的細胞數量。然而，在大多數細胞均有基礎的自噬活動(dòng)，因此大多數細胞將會(huì )有斑點(diǎn)出現。

實(shí)驗方案：通過(guò)LC3免疫細胞化學(xué)實(shí)驗檢測自噬小體數量

免疫細胞化學(xué)/免疫熒光:共聚焦分析Hela-細胞，使用的是LC3B抗體(產(chǎn)品編號 #NB600–1384, 1:5000)。采用Alexa Fluor 488-結合的山羊抗兔IgG作為二抗(綠色)。肌動(dòng)蛋白被標記為Alexa Fluor 568 Phalloidin(紅色)。DAPI用于染細胞核(藍色)

LC3-轉化 (免疫印跡法)

該方法測量LC3的轉化，從未脂化的LC3-I到脂化的LC3 - II型。轉化率的增加與自噬小體的數量增加有關(guān)。量化應該基于LC3 - II水平與內參蛋白(如ACTIN)水平的比較。然而，在某些系統中，內參蛋白的水平受到自噬的影響，此時(shí)LC3-I可被用來(lái)作比較。

自噬流監測

自噬流牽涉到細胞內物質(zhì)的整個(gè)變化過(guò)程，從分離到降解，再將基本組分回收到胞質(zhì)的整個(gè)過(guò)程。

LC3轉變分析(WB, ICC/IF)

這一檢測方法可以監測自噬小體的累積，以確定自噬流。用溶酶體藥物和蛋白酶抑制劑可以阻斷自噬流和LC3-II的降解。用有無(wú)這些試劑時(shí)LC3-II的數量差異來(lái)反映自噬流的變化。這一實(shí)驗使研究人員能夠區分真實(shí)的自噬誘導和自噬流的阻斷。

實(shí)驗方案：Western Blot檢測LC3-II轉變實(shí)驗

Hela人類(lèi)宮頸上皮癌敏感細胞系和LC3B敲除的Hela細胞系，不處理或50μM氯喹處理18h。全細胞蛋白裂解物在1×Laemmli的樣品緩沖液中溶解，以每個(gè)裂解物10μg上樣至4-15%SDS- PAGE凝膠分離蛋白，轉膜至0.2 μm 的PVDF膜，用含5%的脫脂奶粉的TBST封閉液來(lái)封閉。 PVDF膜用(A)兔抗LC3B多克隆抗體(產(chǎn)品編號#NB100-2220)和(B)兔抗LC3B單克隆抗體 (產(chǎn)品編號#NBP2-46892)作為一抗，二抗為HRP-標記的抗兔IgG。在親本Hela細胞系中，特異的LC3B條帶在約15kDa(如圖所示)，但在LC3B敲除的Hela細胞系中檢測不到。GAPDH為內參蛋白。此實(shí)驗條件被簡(jiǎn)化過(guò)。

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