轉自：Abcam公眾號

PD-1/PD-L1單克隆抗體藥備受矚目，是目前臨床上研究和應用最廣泛的免疫檢查點(diǎn)抑制劑之一，阻斷PD-1與PD-L1的結合，使T細胞恢復腫瘤殺傷活性，在多種腫瘤治療過(guò)程中顯示出卓越的療效[1]。

目前FDA批準了2款PD-1抑制劑（Opdivo和Keytruda）和3款PD-L1抑制劑（Tecentriq、Imfinzi、Bavencio）上市。同時(shí)，也分別批準了相應的伴隨/補充診斷抗體：28-8、22C3、SP142、SP263（克隆號，其中Bavencio無(wú)指定PD-L1診斷抗體）這4個(gè)PD-L1單抗，用于PD-L1表達水平的IHC檢測[2]。就在上周6月15日，BMS的PD-1單抗藥物納武利尤（Opdivo, Nivolumab）的中國上市申請正式獲得CFDA批準，用于二線(xiàn)治療非小細胞肺癌。值得注意的是，這四個(gè)克隆號中有一半(28-8、SP142) 為abcam上市產(chǎn)品。

使用不同的診斷抗體，針對不同的腫瘤類(lèi)型均有其獨有的PD-L1打分機制。Opdivo在NSCLC的臨床診斷中使用了PD-L1兔單抗28-8（ab205921, Abcam），它只統計腫瘤細胞膜染色（TC）的百分比。而對于SP142( ab228462, Abcam)，除了TC之外，也加入了對于腫瘤浸潤的免疫細胞（IC）染色的評判，是唯一一個(gè)對腫瘤細胞和腫瘤浸潤的淋巴細胞均加以統計的檢測抗體：評估基于PD-L1任何強度表達的腫瘤浸潤性免疫細胞占腫瘤面積的比例（%IC）或PD-L1任何強度表達在腫瘤細胞中的比例（%TC）。然而這兩種打分機制并無(wú)優(yōu)劣之分。

PD-L1[28-8]的優(yōu)勢

如表1所示，PD-L1[28-8]作為PD抑制劑的補充診斷抗體，已經(jīng)獲得了FDA批準用于NSCLC和黑色素瘤患者的臨床診斷[3]，具有特異性（經(jīng)KO驗證）、具有高靈敏性（兔單抗RabMab）、高重復性（重組抗體）等優(yōu)點(diǎn)。

來(lái)自Abcam的質(zhì)檢數據

在生理或病理情況下human不同器官中的細胞定位（圖1-a）；在KO的人肺腺癌細胞L2987 L2-14克隆中的流式驗證（圖1-b）；極低的批間差（圖1-c， A為負參照，B-F為不同批次抗體）。

來(lái)自診斷平臺的數據

國際肺癌研究協(xié)會(huì )（IASLC）牽頭發(fā)起的 Blueprint 項目對上述 4 種 PD-L1 IHC 檢測克隆進(jìn)行了比較。結果顯示，28-8、22C3 和 SP263 顯示出相似的腫瘤細胞陽(yáng)性染色百分比（圖2-a）；而SP142 相對特殊，SP142染色陽(yáng)性的腫瘤細胞較少,對腫瘤細胞的染色呈“點(diǎn)狀”特性[4]，另一方面，SP142 相比于其他 3 種克隆對免疫細胞的染色更為突出（圖2-b）[4]。

來(lái)自科研用戶(hù)的數據

如圖3所示：無(wú)論是IHC檢測還是流式檢測，PD-L1診斷抗體28-8與PD-L2并無(wú)交叉反應，呈現出高特異性[5]。

與競爭對手的PD-L1抗體相比，28-8與SP142擁有更高的特異性與靈敏度[3]。

如圖4，Abcam[28-8] vs CST [E1L3N]，數據顯示有些PD-L1診斷抗體并不特異[6]，作者分別使用PD-L1 28-8和 E1L3N 抗體，對野生型和敲除的人肺腺癌細胞系L2987和人卵巢透明細胞癌細胞系ES-2的石蠟切片進(jìn)行了IHC染色：在其他條件保持一致的情況下，兩種抗體（2 ug/mL）在L2987的KO細胞中均未檢出信號（圖7A-D）；28-8（3 ug/mL）在ES-2的KO細胞中未檢測到信號，但E1L3N（2 ug/mL）卻呈現了非特異的胞漿染色（圖7E-H），這可能是因為識別了胞漿中的非PD-L1抗原[7]。

對20名NSCLC和20名黑色素瘤患者的TC和IC的IHC檢測結果顯示：相對于E1L3N，28-8是一個(gè)更優(yōu)秀的伴隨診斷抗體[3]。

PD-L1[SP142]的優(yōu)勢

Abcam已與Spring Bioscience簽署了獨家協(xié)議，由Abcam獨家提供其經(jīng)IHC應用優(yōu)化的重組兔單抗SP克隆產(chǎn)品線(xiàn)。SP克隆是被開(kāi)發(fā)專(zhuān)用于病理學(xué)和癌癥研究的抗體。它們使用與Abcam現有 RabMAb® 兔單抗相同的技術(shù)，能確保高特異性，高靈敏度，及批次間的一致性。包括關(guān)于FDA批準的PD抑制劑Tecentriq的補充診斷抗體SP142(圖5)，該抗體同時(shí)也被國內第一家申報上市的PD-1單抗（君實(shí)JS001）作為診斷抗體。與競爭對手的E1L3N相比，無(wú)論特異性還是靈敏度，SP142都更勝一籌[7]：當對Placenta染色時(shí)，SP142的工作濃度為0.44 μg/mL，而獲得同級別染色強度的E1L3N為28 μg/mL；與此同時(shí)在使用E1L3N對Stomach和Nerve的IHC結果中出現了非特異的染色信號，而SP142并未出現此類(lèi)結果[7]。

28-8 使用注意事項

手工操作

在使用28-8這一優(yōu)異的抗體時(shí)，為了確保您獲得出色的實(shí)驗結果，請您務(wù)必配套使用如下試劑。

對于自動(dòng)化免疫組儀平臺和系統，推薦BioGenex i6000 with off-line HIER、 Leica BOND RX with on-line HIER、 Ventana Ultra with on-line HIER以及 Dako Omnis四種平臺。
 

1）根據HE評估樣本是否合適（如無(wú)腫瘤組織和形態(tài)以及是否壞死）；

2）水平質(zhì)控是否合格（試劑對照和組織對照）；拍照時(shí)所有樣本除了調整視野和焦距以外，顯微鏡其他部件一律不能動(dòng)。

3）所有病例都必須采用配套增強試劑盒；

4）不合適的固定方法和時(shí)間會(huì )直接導致假陰性；

5）房間溫度需控制在18～25℃，保持恒定的室溫是染色成功的基本條件；

6）可靠的評估系統。

PD-L1  IHC 28-8 pharmDx打分規則：

如圖6所示，PD-L1蛋白表達的定義是腫瘤細胞所呈現的任何強度的細胞膜陽(yáng)性的百分率，細胞質(zhì)染色（如果存在）不參與評分。根據陽(yáng)性參照（可使用細胞石蠟切片）的染色結果將染色強度分為0（negative）、1+（weak intensity）、2+（moderate intensity）以及3+（strong intensity）；在至少兩個(gè)染色強度條件下，至少80%細胞顯示膜染色陽(yáng)性，負參照背景強度小于1同時(shí)無(wú)膜著(zhù)色信號。

不完整的腫瘤細胞膜染色pattern和完整的腫瘤細胞膜染色pattern均在打分范圍內；

在整個(gè)樣本中不僅膜染色，也出現細胞質(zhì)陽(yáng)性染色，應排除在打分之外；

免疫細胞染色，應排除在打分之外（圖5）[5]。也可以參考表5中的一些建議嘗試解決自動(dòng)化檢測平臺中的常見(jiàn)問(wèn)題。

除28-8外，Abcam還開(kāi)發(fā)了針對PD-L1的兔單抗EPR19759(ab213524)，該抗體在IP和WB等應用中表現十分優(yōu)異。

針對“one drug, one assay”模式，由FDA牽頭，四家PD抑制劑研發(fā)企業(yè)和兩家學(xué)術(shù)機構參與的“藍圖倡議”（Blueprint Initiative）正在試圖找到其可能的一致性，希望在不久的將來(lái)，針對PD-L1 IHC的檢測更加規范化。

參考文獻

1. Chen, D.S. and I. Mellman, Elements of cancer immunity and thecancer-immune set point.Nature, 2017. 541(7637):p. 321-330.

2. Ancevski Hunter,K., M.A. Socinski,and L.C.Villaruz, PD-L1 Testing in Guiding Patient Selection for PD-1/PD-L1 Inhibitor Therapy in LungCancer. Mol Diagn Ther, 2018. 22(1):p. 1-10.

3. Cogswell, J., etal., An Analytical Comparison of Dako28-8 PharmDx Assay and an E1L3N Laboratory-Developed Test in theImmunohistochemical Detection of Programmed Death-Ligand 1. Mol Diagn Ther,2017. 21(1): p. 85-93.

4. Hirsch, F.R., etal., PD-L1 Immunohistochemistry Assaysfor Lung Cancer: Results from Phase 1 of the Blueprint PD-L1 IHC AssayComparison Project. J Thorac Oncol, 2017. 12(2): p. 208-222.

5. Phillips, T., etal., Development of an automated PD-L1immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. ApplImmunohistochem Mol Morphol, 2015. 23(8):p. 541-9.

6. Velcheti, V., etal., Programmed death ligand-1 expressionin non-small cell lung cancer. Lab. Invest., 2014. 94(1): p. 107-16.

7. Liao Z, Z.Y., CaiW, Zhang H, Alleman-Sposeto J, Smith S, et al., IHC performance of two rabbit anti-human PD-L1 monoclonal antibodies. Pleasanton: Spring Bioscience; 2014. https://products.springbio.com/products/PD-L1-CD274-SP142-/M442.

8. Ishida, Y., etal., Induced expression of PD-1, a novelmember of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death.EMBO J, 1992. 11(11): p. 3887-95.

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