一、 實(shí)驗準備

1． 標本制備：         2． 最小化非特異性結合：

二、凋亡

1．凋亡的檢測方法：網(wǎng)站和其它         2．PI染色法

3．Annexin V 法         4．TUNNEL法

三、細胞因子

1．激活的細胞因子         2．CBA

四、血小板

1．活化         2．活化檢測

3．網(wǎng)織血小板

五、紅細胞

1．網(wǎng)織紅細胞         2．PNH

3．胎兒紅細胞

六、腫瘤學(xué)

1．DNA 細胞周期         2．蛋白

3．多藥耐藥         4．微小殘留白血病

第一部分  標本處理

一、流式細胞術(shù)常規檢測時(shí)的樣品制備

 (一)直接免疫熒光標記法

取一定量細胞(約1X106細胞／ml)，在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上(),再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標記反應(如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時(shí)加入)，。孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡(jiǎn)便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數同時(shí)測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。

 (二)間接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液(約1X106細胞／ml)，先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實(shí)驗結果。所以標本制備時(shí)應加入陰性或陽(yáng)性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。

二、最小化非特異性結合的方法

1．熒光標記的抗體的濃度應該合適，如果濃度過(guò)高，背景會(huì )因為非特異性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗體之前，將樣品與過(guò)量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來(lái)自于同一寄主的正常血清來(lái)作為標記的第二抗體。這個(gè)步驟通過(guò)阻斷第一抗體和細胞表面或胞內結構的非特異性的交互作用來(lái)降低背景。

3．在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來(lái)自于同一寄主的正常血清和作為標記的第二抗體一起培育。這個(gè)步驟會(huì )減少不必要的第二抗體與第一抗體、細胞表面或胞內結構之間的交互作用。
通過(guò)用來(lái)自于同樣的樣品的血清稀釋標記過(guò)的抗體可以略過(guò)此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時(shí)候它也會(huì )導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會(huì )優(yōu)先與一些細胞結構進(jìn)行結合，或者它們最終會(huì )導致期望得到的抗體活性的丟失。

4．使用F(ab’)2片段會(huì )使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結合。大多數的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，FC受體決定的背景影響已不再重要。

5．其它：已標記的抗體和其他一些內在的免疫球蛋白或加入實(shí)驗系統中的其它物質(zhì)的交叉反應也可能會(huì )有背景影響。為了降低背景，在多重標記過(guò)程中，所有的已標記的抗體應被吸附，避免其他種類(lèi)蛋白的交叉反應。
 

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