PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長(cháng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶 　核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(huì )形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個(gè)堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物　量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。

酶及其濃度：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會(huì )使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì )引起錯配。濃度過(guò)低又會(huì )降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標本。

SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著(zhù)的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過(guò)低會(huì )降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。

PCR反應條件的選擇：PCR反應條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數。

溫度與時(shí)間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標準反應中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長(cháng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(cháng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì )導致PCR失
敗。

②退火(復性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會(huì )遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(cháng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(cháng)度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　　　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

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