1、引物設計

細心地進(jìn)行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會(huì )同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿(mǎn)意的特點(diǎn)：

1.典型的引物18到24個(gè)核苷長(cháng)。引物需要足夠長(cháng)，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(cháng)度大于24核苷的引物并不意味著(zhù)更高的特異性。較長(cháng)的序列可能會(huì )與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

3.設計5'端和中間區為G或C的引物。這會(huì )增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

4.避免引物對3'末端存在互補序列，這會(huì )形成引物二聚體，抑制擴增。

5.避免3'末端富含GC。設計引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。

6.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7.避免存在可能會(huì )產(chǎn)生內部二級結構的序列，這會(huì )破壞引物退火穩定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應該對其進(jìn)行互補性和內部二級結構的檢測。

有時(shí)候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

2、引物退火溫度

引物的另一個(gè)重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

設定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tm最常用的兩種方法。第一個(gè)公式來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個(gè)公式根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。

根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì )差異很大。因為大部分公式提供一個(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì )減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結果，兩個(gè)引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì )引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

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