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首先將培養好的人肺泡上皮細胞（HPAEpiC）接種到芯片的上腔室，之后將芯片倒置在下層腔室接種人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC），培養一段時(shí)間后，利用流體控制系統在上腔室注入空氣取代上腔室中的培養基，在下腔室連續灌注培養基，以建立氣體-液體界面（ALI）培養環(huán)境，培養若干天后，將巨噬細胞接種到HPAEpiC細胞表面，之后再動(dòng)態(tài)培養24-48小時(shí)，構建好的肺芯片模型能夠模擬體內的肺泡-毛細血管屏障結構（圖1，圖2A）。

在肺芯片中，光學(xué)成像和基于熒光的活/死細胞染色成像顯示上下腔室的上皮細胞和內皮細胞均形成了連續的細胞層（圖2B和C）?；跓晒夤簿劢钩上竦娜S重構也表明培養室中的細胞趨向于逐漸形成連續層，從而構建出完整的上皮和內皮層（圖2D）。緊密連接蛋白（E-鈣粘蛋白和VE-鈣粘蛋白）的陽(yáng)性表達以及氣液培養過(guò)程中穩定的跨膜電阻(Teer)值均表明在芯片上構建了結構完整和生理功能完善的肺泡-毛細血管屏障（圖2E和F）。同時(shí)肺芯片能夠維持穩定超過(guò)兩周。

圖 1. 肺芯片系統。A：肺芯片設計和加工；B：流體控制系統；C：肺芯片和PS-NPs暴露示意圖。

圖2 肺模型構建和特征。A: 肺芯片構建時(shí)間線(xiàn)；B: 肺芯片明場(chǎng)成像；C: 死活細胞染色；D: 肺芯片熒光共聚焦成像3D重構圖；E: 緊密連接蛋白免疫熒光；F：氣液培養過(guò)程中肺模型TEER值變化。

通過(guò)測試肺芯片暴露于不同種類(lèi)的代表性環(huán)境污染物中的表現，可以用于建立環(huán)境毒理學(xué)研究平臺。本研究將構建的肺芯片模型暴露于不同種類(lèi)（生物氣溶膠、化學(xué)污染物和納米顆粒）的環(huán)境污染物（脂多糖、銅納米顆粒、銀納米顆粒、氧化鋅納米顆粒、氧化鋁納米顆粒、香煙煙霧提取物）24h，通過(guò)死活細胞染色成像和細胞活性分析顯示，在熒光圖像中芯片中的活細胞數量顯著(zhù)減少，而死細胞數量增加（圖3A），同時(shí)細胞活性顯著(zhù)降低（圖3B）。同時(shí)通過(guò)檢測TEER值和滲透系數值以及熒光標記的葡聚糖定量，結果均表明環(huán)境污染物破壞了模型的屏障功能（圖3C&3D）。進(jìn)一步通過(guò)分析肺損傷相關(guān)的炎癥因子分泌、活性氧(ROS)生成、THP-1（人白血病單核細胞）細胞粘附、抗胰蛋白酶(AAT，COPD標志物)表達（圖4），顯示肺芯片可以從多個(gè)維度分析環(huán)境污染物對于呼吸系統健康的損害，如炎癥因子釋放、更多的單核細胞粘附血管內皮細胞層、ROS過(guò)量生成、AAT表達減少，證明作為一種穩定和可靠的模型，肺芯片系統可以用于不同環(huán)境污染物的毒理學(xué)研究。

在模型暴露于PS-NPs 24小時(shí)后，通過(guò)死活細胞雙熒光染色分析，結果表明納米塑料以劑量效應的方式引起人肺上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞的死亡（圖5A），其中低劑量和中等劑量的PS-NPs(7.5和15μg/cm²)對細胞活力基本無(wú)影響，但30μg/cm²的PS-NPs顯著(zhù)抑制了細胞活力（圖5B）。結合低劑量下TEER值增加，猜測這可能由于保護性應激反應。綜合分析不同劑量下的TEER值和FITC-葡聚糖擴散，結果均表明PS-NPs能破壞肺泡-毛細血管屏障的結構完整性和屏障功能（圖5C&5D）。

將單核細胞灌注到血管通道以研究肺芯片在PS-NPs刺激下引發(fā)的炎癥介導的免疫反應，結果顯示細胞因子（IL-6、MCP-1和TNF-α）的水平在不同劑量暴露下均呈現顯著(zhù)增長(cháng)（圖6A）。同樣，在不同劑量組中均觀(guān)察到大量的THP-1細胞粘附在內皮層上（圖6B），表明在肺芯片中不同細胞之間存在相關(guān)交流。作為炎癥進(jìn)展中的重要信號分子，研究人員進(jìn)一步檢測了活性氧(ROS)的生成，由PS-NPs誘導ROS生成表現出劑量-效應關(guān)系。有趣的是，在較低劑量暴露下HUVEC細胞的熒光信號比HPAEpiC顯著(zhù)更弱，而在高劑量下兩種細胞的ROS生成相當，這也證實(shí)了模型的屏障功能及細胞間存在相互作用。（圖6C）。

為了評估PS-NPs與細胞的相互作用，研究人員通過(guò)流式細胞術(shù)測量了肺芯片中PS-NPs的攝取情況。實(shí)驗結果顯示，PS-NPs以劑量依賴(lài)的方式在人肺上皮細胞/巨噬細胞、人臍靜脈內皮細胞和THP-1細胞中積累。其中，PS-NPs在上皮細胞的內化率遠高于其他細胞類(lèi)型，僅在高劑量下觀(guān)察到THP-1細胞對PS-NPs的攝取量增加（圖6D）。結果同時(shí)還表明，PS-NPs首先被人肺上皮細胞/巨噬細胞攝取，通過(guò)破壞肺泡-毛細血管屏障，隨后進(jìn)入血液系統影響其他器官。為了進(jìn)一步確認PS-NPs對慢性阻塞性肺疾病(COPD)風(fēng)險的影響，研究人員檢測了抗胰蛋白酶(AAT)的表達。在芯片經(jīng)PS-NPs處理后，觀(guān)察到了AAT值以劑量依賴(lài)性方式顯著(zhù)降低（圖6E）。